С помощью микрофлюидика устройства для механической стимуляции и высокой резолюции визуализация C. elegans

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы измерить, как нематоды и их нейроны реагируют на внешние механические стимулы с помощью микрофлюидной чиповой установки с приводами под давлением. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области механобиологии и сенсорной биологии, такие как реакция клеток, тканей и животных на механическую стимуляцию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он в достаточной степени снижает подвижность червя неинвазивным способом, что позволяет получать изображения с высоким разрешением, сохраняя при этом доступ к кутикуле червя для механической стимуляции.

Этот метод также может быть использован для изучения влияния механических сигналов на развитие. Он может быть даже применен к другим системам, таким как ex vivo organ exponse или другим животным, похожим по размеру на C.Elegans. Настройка системы микроскопа для одновременного возбуждения ГХаМП и РЧП.

Одним из вариантов является незаметный источник света, который пропускает только голубой и желтый свет. Для просмотра используйте 10-кратный объектив и объектив с большим увеличением. Кроме того, отправьте изображение на компьютер через цифровую камеру.

Далее в комплект входит флоресцентный куб и, при необходимости, фильтр возбуждения. Добавьте к кубу дихроичное зеркало, которое отражает голубой и желтый свет и пропускает зеленый и красный свет. Установите светоделитель с длиннопроходным дихроичным зеркалом с отсечкой на 570 нанометров.

Кроме того, предусмотрите полосовой фильтр излучения для зеленого света на 525 нанометрах с шириной 50 нанометров и полосовой фильтр излучения для красного света на глубине 632 нанометра и шириной 60 нанометров. Проецируйте оба луча в поле зрения камеры. Убедитесь, что зеленая часть проецируется в верхнюю половину экрана, а красная — в нижнюю.

Всегда используйте микрофлюидные чипы, выпущенные менее одного месяца назад. Для настройки сначала загрузите резервуар самотечного потока с помощью отфильтрованного M9. Расположите резервуар примерно в 60 сантиметрах над чипом и подключите его к выходному отверстию для чипа. Затем подключите другой выход к контейнеру для отходов с двумя входами, а второй вход подключите к контейнеру для отходов к перистальтическому насосу.

Все соединения выполнить с помощью полиэтиленовой трубки. Далее соберите межсоединения длиной 50 миллиметров с металлическими трубками на обоих концах. Запрессуйте и соедините друг с другом каждый из шести пальцев привода и во впускное отверстие червяка.

Теперь расположите чип под оптикой. Обязательно оставьте межблочные соединения прикрепленными к чипу, так как PDMS будет быстро изнашиваться при повторных манипуляциях. Крайне важно, чтобы привод PDMS и трубка, соединяющая чип с воздушным резервуаром, были надежно герметизированы, чтобы обеспечить хорошее хроматическое срабатывание мембраны.

Перед загрузкой животных проверьте потерю давления в микрофлюидном чипе. Измерьте прогиб мембраны, выполнив несколько циклов срабатывания при требуемом давлении. Затем сравните количественные значения с теоретическими прогнозами.

Если измеренные значения не соответствуют ожидаемым, проверьте наличие утечек в трубках или соединительных трубках. PDMS также может иметь различную эластичность из-за альтернативного соотношения основного полимера и отвердителя, или масса PD может быть старой и чрезмерно сшитой. Подготовили синхронизированные по возрасту с молодым взрослым или взрослым днем одного C.elegans, как описано Porta-de-la-Riva и компанией в их публикации Jove от 2012 года.

Теперь выберите от двух до пяти молодых людей или однодневных гермафродитов. Выбор животных правильного размера имеет решающее значение. Мелкие животные не попадут в ловушку в канале, а слишком крупных животных будет сложно удалить и они могут засорить устройство.

Вытащите сорванных червей в каплю процеженного М9. Затем втяните их в длинную трубку с помощью одномиллилитрового шприца, не втягивая их в сам корпус шприца. Далее подсоедините трубку к межсоединению на червячном входе микросхемы. Затем активируйте самотечный поток, открыв клапан в резервуаре и запустив насос.

Теперь понаблюдайте за каналом отлова при четырехкратном увеличении и осторожно затолкайте животных в устройство. После загрузки животных в камеру ожидания с помощью поршня осторожно переместите одного из них в переднюю часть ловчего канала таким образом, чтобы его голова вошла в сужающуюся форму канала. Если червь не заполняет все поперечное сечение канала от носа до ближайшего конца тела, удалите червя.

Во многих случаях черви, которые слишком малы, проходят прямо через чип, не попадая в ловушку. Если животное, попавшее в ловушку, необходимо удалить, просто нажмите на поршень шприца до тех пор, пока червь не исчезнет из канала, а затем загрузите нового червя. Как только червь будет правильно заряжен, переключитесь в режим флуоресценции и увеличьте увеличение.

Чтобы предотвратить насыщение, обязательно регулируйте интенсивность возбуждения исходя из интенсивности цветения. Проверьте, не лежит ли нейрит интересующего нейрона поперек диафрагмы одного из приводов. Этот актуатор также должен находиться перед клеточным телом нейрона.

Если нет, отрегулируйте положение животного, потянув или надавив на поршень. Если это не помогло, удалите червя и загрузите новый. Кроме того, если вокруг нейрона наблюдается аутофлуоресценция, замените червя.

После того, как червь будет правильно загружен, сосредоточьтесь на клеточном теле интересующего нейрона, затем определите, какой привод чипа находится на его передней стороне, и подключите этот привод к программируемому насосу давления с помощью соответствующего межсоединения. Если эксперимент требует измерения расстояния между актуатором и нейроном, поместите оба в поле зрения так, чтобы стенка канала была параллельна верхнему и нижнему краю изображения. Затем определите протокол измерения давления с помощью программируемого нагнетательного насоса.

Всегда начинайте со съемки не менее 50 изображений с нулевым значением килопаскалей, чтобы определить базовую линию. Затем запрограммируйте форму волны стимула и давление. Теперь запустите протокол визуализации и давления.

Во время записи интересующий нас нейрон должен быть самым ярким пятном в области площадью 10 квадратных пикселей. Он не может перемещаться более чем на 10 пикселей на двух последовательных изображениях и должен оставаться в поле зрения. Во время записи вы можете наблюдать изменения интенсивности цветения при изменении давления и приводов.

Это свидетельствует об успешной стимуляции нейронов. Между раздражителями включайте 10 секунд при постоянном давлении нулевого килопаскаля. Возможна одновременная запись сигналов от нескольких нейронов в поле зрения при условии, что они разделены не менее чем на 10 пикселей в течение всей записи.

Чтобы сохранить червей для дальнейшего изучения, отсоедините выпускные отверстия чипа по направлению к гравитационному потоку и контейнеру для отходов. Затем осторожно нажимайте на поршень до тех пор, пока весь червь не будет протолкнут через улавливающий канал в проточный канал, и продолжайте нажимать на поршень до тех пор, пока животное не появится в виде капли за пределами чипа. Теперь отсоедините шприц от трубки и аспирируйте червячка в капле на агаровую пластину.

Чтобы удалить и пожертвовать червяком в канале, нажмите на поршень до тех пор, пока весь червяк не будет протолкнут через улавливающий канал в проточный канал. Затем червяк вытечет из чипа в контейнер для отходов. После настройки микрофлюидного чипа было проверено отклонение диафрагмы.

Измеренные значения были воспроизводимыми с незначительным отклонением, не превышающим одного микрона при давлении 450 килопаскаль. После вставки червей во входное отверстие чипа шкура одного животного внутри улавливающего канала была подана шести приводам. При такой конструкции PLM-нейрон обычно не может быть полностью обездвижен, поэтому он может свободно перемещаться в горизонтальном и вертикальном направлении.

Хотя успешная активация PLM-нейронов возможна, регистрация кальциевых транзиентов из них затруднена из-за движения хвоста. Оказавшись на месте, животное стимулировалось с помощью одного из шести приводов, расположенных для доставки механических стимулов к каждому из шести TRN. Был представлен один из трех различных двухсекундных стимулов.

Удержание на 275 килопаскалей, нарастание до 275 кПа или жужжание, состоящее из 75-килопаскального 10-герцового синуса, наложенного на 275-килопаскальный шаг. 10-секундные промежутки без давления разделяли раздражители. Нарастание давления и ступени давления активировали ТРН только в том случае, если стимулы достигали давления выше 400 килопаскалей, в то время как жужжащие стимулы надежно активировали все ТРН.

После освоения этой техники ее можно выполнить в течение пяти минут на одного червя. Важно помнить, что плохое уплотнение между чипом и покровным стеклом, или между чипом и межразъемными соединителями, приведет к утечке и выходу из строя устройства. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация напряжения или адресная доставка механических стимулов к различным нейронам, чтобы охарактеризовать механический ответ ноцицепторов.

Кроме того, поскольку животные могут быть восстановлены после этой процедуры, этот метод может быть использован для скрининга мутантов с дефектной реакцией на механические стимулы. Не забывайте, что работа со сжатыми газами и химическими веществами может быть чрезвычайно опасной. Примите меры предосторожности, такие как ношение индивидуальной защитной одежды и работа в вытяжных шкафах, когда это необходимо, чтобы избежать этих опасностей.