Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые

Общая цель данной процедуры заключается в электроспиннинге трехмерного фазного каркаса, позволяющего проводить совместное культивирование полностью дифференцированных взрослых клеток человека для имитации природного внеклеточного матрикса, с которым эти клетки сталкиваются в C two. Это достигается путем предварительного электроспиннинга каркаса из хаотично ориентированных микроволокон. На втором этапе формируется двухфазный каркас путем электроспиннинга слоя хаотично ориентированных нановолокон непосредственно на микроволоконный каркас.

Затем методом электроспиннинга создается отдельный скаффолд из ориентированных нановолокон. Заключительным этапом является заселение каждого скаффолда соответствующим типом клеток и совместное культивирование скаффолдов в системе перфузионного биореактора в виде единой конструкции. В конечном итоге многоклеточные взаимодействия можно проанализировать путем измерения высвобождения медиаторов и иммуноокрашивания.

Конструкция. Основное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как 2D-трансформированные мембраны, заключается в том, что электрические каркасы обеспечивают трехмерную волокнистую среду, которую можно адаптировать для создания физиологически релевантной морфологии. Такая структура обладает более высокой пористостью и позволяет осуществлять совместное культивирование нескольких типов клеток.

Данный метод обеспечивает создание стабильной платформы с использованием когортных, патологически измененных или здоровых клеток человека в качестве модели in vitro. Это поможет снизить зависимость от животных моделей, имеющих ограниченную релевантность заболеваниям человека, и сократить количество животных, используемых в экспериментах. Хотя этот метод позволяет получить представление о таких заболеваниях, как астма и ХОБЛ, он также может быть применен к другим системам, например, для изучения воспалительных заболеваний кишечника или для разработки модели кожи для химического тестирования.

Для начала приготовьте три различных растворов ПЭТ объемом 10 миллилитров, растворяя 8%, 10% и 30% ПЭТ в смесях хлорметана и трихлоруксусной кислоты в соотношении один к одному. Перемешивайте растворы в течение ночи при комнатной температуре, чтобы ПЭТ полностью растворился к следующему дню. Перенесите растворы ПЭТ в шприцы и закрепите иглу 23G на шприце с 8% смесью и иглы 18G на двух других шприцах с 10% и 30% растворами ПЭТ.

Подготовьте микроволоконный каркас. Сначала установите шприц с 30% PET-раствором в шприцевой насос кончиком иглы вниз. Расположите приемник на расстоянии 15 сантиметров от кончика иглы и убедитесь, что игла направлена в центр барабана.

Подсоедините линию положительного электропитания к кончику иглы с помощью металлического зажима-«крокодила» и заземлите манекен, подключив линию заземления к разъему типа «банан». Включите двигатель и установите скорость вращения манекена на 60 RPMs. Включите шприцевой насос, чтобы обеспечить скорость потока 2.0 milliliters per hour.

При создании микроволоконных каркасов дайте насосу поработать до тех пор, пока раствор не начнет выходить из кончика иглы, чтобы подготовить систему, удалив из иглы весь воздух. Затем остановите шприцевой насос.

Установите общий объем вытесняемого раствора на 2 мл и запустите насос. Затем приложите разность потенциалов 14 кВ между иглой и мандрелем для электроспиннинга в течение одного часа, пока не будет переработано 2 мл 30% раствора PET; когда микроволоконный каркас будет сформирован на мандреле, отключите напряжение. Снимите зажим «крокодил» и замените шприц с 30% раствором PET на шприц с 8% раствором PET.

Затем снова подсоедините зажим «крокодил» к игле калибра 23. Измените скорость потока шприцевого насоса на 0.5 milliliters per hour и заполните иглу, запустив насос до тех пор, пока раствор не начнет вытекать из кончика. При продолжении вращения мандреля со скоростью 60 RPMs подайте потенциал 14 kilovolt между кончиком иглы и мандрелем, и установите общий объем выдавливаемого шприцевым насосом раствора на два milliliters.

Проводите электроспиннинг в течение четырех часов, пока не будет переработано 2 мл 8% раствора PET. По завершении процесса электроспиннинга выключите источник питания и двигатель, вращающий оправку. С помощью лезвия вырежьте двухфазный скаффолд по ширине оправки, чтобы получить 2D-лист скаффолда, размер которого соответствует площади поверхности оправки.

Для приготовления ориентированных ПЭТ-скаффолдов установите шприц с 10% раствором ПЭТ в шприцевой насос иглой вниз. Затем подсоедините зажим «крокодил» к игле. Установите скорость потока 0.5 milliliters per hour и заполните иглу раствором ПЭТ.

Затем включите двигатель и установите скорость вращения оправки на 2000 RPMs. Далее включите шприцевой насос. Установите напряжение источника питания на 14 kilovolts и включите электроспиннинг на четыре часа, пока не будет переработано два миллилитра раствора.

После завершения электроспиннинга выключите источник питания и двигатель. Отрежьте скаффолд лезвием вдоль ширины оправки, чтобы получить выровненный 2D-лист скаффолда. Храните полученные электроспиннинговые скаффолды в алюминиевой фольге для снижения электростатического заряда.

С помощью биопсийного панча диаметром 0.8 millimeter вырежьте диски из двухфазных или ориентированных скаффолдов из листов SPU. Затем приклейте диск двухфазного скаффолда к прокладке, используя нетоксичный аквариумный клей. Поместите прокладки со скаффолдами в 12-луночный планшет для культивирования тканей.

Стерилизуйте прокладки и скаффолды с помощью ультрафиолетового излучения спектра I в течение 30 минут с каждой стороны скаффолдов. Затем выдержите их в 20% растворе антибиотиков и антимикотиков в течение ночи при температуре four degrees Celsius. Промойте скаффолды PBS 3 раза и храните их в PBS при температуре four degrees Celsius до использования.

Перенесите двухфазные скаффолды из PBS в новый 12-луночный планшет и выдержите их в среде DMEM, дополненной 10% FCS, в течение одного часа при 37 °C. Удалите дополненную среду DMEM и, поместив микроволоконную фазу скаффолдов вверх, посейте 15 000 клеток фибробластов MRC-5 в 30 µL дополненной среды DMEM на каждый скаффолд, чтобы способствовать проникновению фибробластов внутрь структуры. Поместите планшет на орбитальный шейкер и перемешивайте скаффолды при 100 RPM в течение двух часов.

Затем добавьте по 2 мл дополненной среды DMEM в каждый скаффолд и инкубируйте скаффолды в течение ночи при 37 °C в атмосфере 5% CO2. На следующий день удалите среду из лунок и переверните скаффолды так, чтобы нановолоконная фаза скаффолдов была обращена апикально. Затем высейте 30 000 эпителиальных клеток Calu-3 в 30 µL среды DMEM/F12, дополненной 10% FCS, на нановолоконную фазу скаффолда.

Инкубируйте скаффолд в течение двух часов при 37 °C и 5% carbon dioxide, после чего погрузите скаффолды в смесь DMEM/F12 и DMEM в соотношении 70:30 с добавками и продолжите статическую инкубацию еще в течение 12 часов для культивирования гладкомышечных клеток дыхательных путей. Сначала перенесите выровненные скаффолды из PBS в новый 12-луночный планшет, прогрейте их и DMEM с добавками в течение одного часа при 37 °C. Удалите DMEM с добавками и добавьте по 25 000 гладкомышечных клеток дыхательных путей в 30 µL DMEM с добавками к каждому скаффолду, затем инкубируйте их в течение двух часов при 37 °C и 5% carbon dioxide.

После прикрепления погрузите скаффолды в среду DMEM с добавками. Поместите их обратно в инкубатор и оставьте на ночь перед созданием тройной культуры в биореакторе. На следующий день поместите двухфазный заселенный скаффолд в камеру биореактора эпителиальной фазой вверх.

Затем поместите выровненный скаффолд под двухфазный скаффолд так, чтобы он находился рядом с микроволоконной фазой двухфазного скаффолда. Зафиксируйте две камеры биореактора вместе. После этого соберите две схемы перфузионного потока в инкубаторе, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, и через одну неделю начните перекачку среды по обеим схемам со скоростью примерно 0.1 milliliters per minute с помощью перистальтического насоса.

Удалите среду из апикальной камеры и культуры. Эпителиальные клетки культивируйте на границе раздела фаз «воздух-жидкость» еще в течение одной недели перед проведением анализа. Спустя две недели пребывания в биореакторе представленный здесь каркас с тройной культурой был фиксирован и разрезан для демонстрации ядер клеток, распределенных по всем трем слоям конструкции; ядра клеток были окрашены DPI и выглядят синими, в то время как материал каркаса выглядит серым. Здесь представлены изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, для электроспиннинговых нановолоконных, микроволоконных и ориентированных каркасов, которые были подготовлены для посева эпителиальных клеток, фибробластов и гладкомышечных клеток соответственно.

Для всех трех типов клеток наблюдалось повышение жизнеспособности при культивировании на соответствующих скаффолдах в течение двух недель. Кроме того, после двухнедельного периода культивирования в каждой из них продолжалась экспрессия белков, специфичных для данного типа клеток. При выполнении данной процедуры важно не забывать изучить состав нативного внеклеточного матрикса, который вы стремитесь воссоздать с помощью электроспиннинговых волокон.

Клетки ведут себя по-разному при прикреплении к различным 3D-топографиям. Например, эпителиальные клетки формируют функциональный барьер только при культивировании на нановолокнах. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать многослойную систему совместного культивирования, которая может быть использована для изучения межклеточных взаимодействий в динамической среде культивирования.

Не забудьте, что при выполнении данной процедуры важно подобрать параметры электроспиннинга, такие как скорость потока и напряжение, в соответствии с полимером и системой растворителей, которые вы намерены использовать. Это имеет решающее значение для получения волокон с заданными свойствами. Кроме того, помните, что электроспиннинг следует проводить в вытяжном шкафу для обеспечения надлежащего удаления растворителей.