Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые In Vitro Модель дыхательных путях стены

Общая цель этой процедуры заключается в электроспинировании трехмерного фазового каркаса, что позволяет проводить совместное культивирование полностью дифференцированных клеток взрослого человека с целью репликации естественного внеклеточного матрикса, с которым эти клетки сталкиваются в С-2. Это достигается с помощью первого электроспиннинга, случайно выровненного каркаса из микрофибры. Второй шаг заключается в формировании двухфазного каркаса путем электровращения случайно выровненного слоя нановолокна непосредственно на каркасе из микрофибры.

Далее производится отдельный выровненный каркас из нановолокна с помощью электроса. Заключительным этапом является засеивание каждого каркаса соответствующим типом клеток и совместное культивирование скаффолдов в системе биореактора как единой конструкции. В конечном счете, многоклеточные взаимодействия могут быть проанализированы с помощью измерения высвобождения медиаторов и иммуноокрашивания.

Конструкт. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как 2D-преобразованные мембраны, заключается в том, что электрические каркасы обеспечивают трехмерную волокнистую среду, которая может быть адаптирована для обеспечения физиологически релевантной морфологии. Это более пористая структура, которая позволяет культивировать ядро нескольких типов клеток.

Этот метод обеспечивает стабильную платформу, используя либо когорты, либо больные, либо здоровые клетки человека в качестве модели in vitro. Это поможет уменьшить нашу зависимость от животных моделей, которые имеют ограничение в своей значимости для болезней человека, и уменьшить количество животных, используемых в экспериментах. Хотя этот метод может дать представление о таких заболеваниях, как астма и ХОБЛ, он также может быть применен к другим системам, таким как изучение воспалительных заболеваний кишечника или для разработки модели кожи для химического тестирования.

Для начала приготовьте три разных 10-миллилитровых раствора ПЭТ, растворив 8%10% и 30%ПЭТ в смесях хлорметана и трихлоруксусной кислоты один к одному. Перемешайте растворы в течение ночи при комнатной температуре, чтобы ПЭТ растворился на следующий день. Перелейте растворы ПЭТ в шприцы и прикрепите иглу 23 калибра к шприцу, содержащему смесь 8%, и иглы 18 калибра к двум другим шприцам, содержащим 10% и 30% растворы ПЭТ.

Подготовьте каркас из микрофибры. Сначала загрузите шприц, содержащий 30%-ный раствор ПЭТ, в шприцевой насос острием иглы внизу. Расположите манипулятор на расстоянии 15 сантиметров от кончика иглы и убедитесь, что игла направлена в центр барабана.

Подсоедините положительный электрический провод к кончику иглы с помощью металлического зажима типа «крокодил» и заземлите кабель, подключив линию заземления к гнезду типа «банан». Включите мотор и установите рабочую скорость на 60 об/мин. Включите шприцевой насос, чтобы обеспечить расход 2,0 миллилитра в час.

При создании каркасов из микрофибры. Дайте насосу работать до тех пор, пока раствор не будет выдавлен из кончика иглы, чтобы заправить систему, удалив воздух из иглы. Затем остановите насос на шприцевом насосе.

Установите общий объем выталкиваемого раствора на уровне двух миллилитров и запустите насос. Затем подайте напряжение в 14 киловольт между иглой и электроспином оправки в течение одного часа, пока два миллилитра 30%-ного раствора ПЭТ не будут раскручены с помощью микрофибрового каркаса, все еще находящегося на оправке, выключят потенциал напряжения. Снимите зажим типа «крокодил» и замените шприц, содержащий 30% раствор ПЭТ, шприцем, содержащим 8% раствор ПЭТ.

Затем снова подсоедините зажим типа «крокодил» к игле 23 калибра. Измените расход шприцевого насоса на 0,5 миллилитра в час и заправьте иглу, запуская шприцевой насос до тех пор, пока раствор не потечет с наконечника. Продолжая вращаться со скоростью 60 оборотов в минуту, подайте напряжение 14 киловольт между кончиком иглы и оправкой и установите общий объем, который должен быть выдавлен шприцевым насосом, равным двум миллилитрам.

Электроспин в течение четырех часов, пока не будет произведено электровращение двух миллилитров 8%-ного раствора ПЭТ. Когда электроспиннинг будет завершен, выключите электропитание и мотор, вращающий оправку. Разрежьте двухфазные леса лезвием по ширине оправки, чтобы получить 2D лист леса размером с площадь поверхности оправки.

Чтобы приготовить выровненные ПЭТ-каркасы, загрузите шприц, содержащий 10% раствор ПЭТ, в шприцевой насос острием иглы внизу. Затем подсоедините зажим типа «крокодил» к игле. Установите скорость потока на 0,5 миллилитра в час и загрунтуйте иглу раствором ПЭТ.

Затем включите мотор и установите скорость отжима оправки на 2000 об/мин. Далее включите шприцевую помпу. Установите напряжение питания на 14 киловольт и включите электроспин источника питания на четыре часа, пока не будет произведено электровращение двух миллилитров раствора.

Когда электроспиннинг завершится, выключите блок питания и мотор. Разрежьте строительные леса лезвием по ширине оправки, чтобы получить выровненный 2D лист строительных лесов. Храните электроспиральные каркасы в алюминиевой фольге для снижения электростатического заряда.

С помощью биопсийной ручки диаметром 0,8 миллиметра выбейте диски двухфазных или выровненных скаффолдов из листов SPU. Затем приклейте диск двухфазного каркаса к прокладке с помощью нетоксичного аквариумного клея. Поместите прокладки и каркасы в 12-луночный планшет для культуры тканей.

Стерилизуйте прокладки и каркасы с помощью ультрафиолетового излучения I в течение 30 минут с каждой стороны каркасов. Затем замочите в 20% антимикотическом растворе антибиотика на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день. Промойте леса с помощью PP S3 раза и храните их в PBS при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы.

Перенесите двухфазные каркасы из PBS в свежую 12-луночную пластину и прогрейте их в среде DMEM, дополненной 10% FCS, в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите среду, дополненную DMEM, и поместите микрофибровую фазу каркаса с семенем 15 000 MRC пяти фибробластных клеток в 30 микролитрах среды, дополненной DMEM, на каждый каркас, чтобы помочь фибробластам проникнуть в каркас. Установите пластину на орбитальный шейкер и взбалтывайте скаффолды со скоростью 100 об/мин в течение двух часов.

Затем добавьте по два миллилитра среды, дополненной DMEM, в каждый каркас и инкубируйте каркасы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На следующий день удалите фильтрующий материал из скважин и переверните скаффолды так, чтобы нановолоконная фаза скаффолдов была обращена апикально. Затем засейте 30 000 Cali три эпителиальных клетки в 30 микролитрах среды D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FCS на нановолоконную фазу каркаса.

Инкубируйте каркас в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, прежде чем погрузить каркас в смесь D-M-E-M-F 12 и среды, дополненной DMEM, и продолжить статическую инкубацию еще на 12 часов для культивирования дыхательных путей. Гладкомышечные клетки сначала перенесите выровненные каркасы из PBS в свежую 12-луночную пластину и согрейте их и дополненную DMEM среду в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Удалите среду, обогащенную DMEM, и добавьте 25 000 клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей в 30 микролитров среды, дополненной DMEM, в каждый каркас и инкубируйте их в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После прикрепления погрузите каркасы в среду, дополненную DMEM. Верните их в инкубатор и оставьте на ночь, прежде чем посадить трикультуру в биореактор. На следующий день поместите двухфазный семенной каркас в камеру биореактора эпителиальной фазой вверх в камеру.

Затем поместите выровненный каркас под двухфазный каркас так, чтобы он примыкал к фазе микроволокна двухфазного каркаса. Зафиксируйте две камеры биореактора вместе. Затем соберите два контура перфузионного потока в инкубаторе, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, и через неделю прокачайте среду вокруг двух контуров со скоростью примерно 0,1 миллилитра в минуту с помощью перистальтического насоса.

Удалите медиа из апикальной камеры и культуры. Эпителиальные клетки на границе воздушной жидкости в течение дополнительной недели перед анализом после двух недель в биореакторе, показанный здесь каркас трех культур был зафиксирован и разрезан так, чтобы показать, что ядра клеток, распределенные по всем трем слоям ядер конструктивных клеток, были окрашены DPI и выглядят синими там, где материал каркаса выглядит серым. Вот изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа микроволокна и выровненных скаффолдов, которые были подготовлены для посева эпителиальных клеток, фибробластов и гладкомышечных клеток соответственно.

Все три типа клеток показали увеличение жизнеспособности при культивировании на их индивидуальных каркасах в течение двухнедельного периода. Каждый из них также продолжал экспрессировать специфические для клеточного типа белки после двухнедельного периода культивирования. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости исследования нативного внеклеточного матрикса, который вы пытаетесь воссоздать с помощью электроволокон.

Ячейки будут вести себя по-разному при присоединении к разным 3D топографиям. Например, эпителиальные клетки образуют функциональный барьер только при культивировании на нановолокнах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как построить многоуровневую систему сокультуры, которая может быть использована для изучения межклеточных взаимодействий в динамической культуральной среде.

Не забывайте, что важно настроить параметры электроспиннинга, такие как расход и напряжение, в соответствии с полимерной и сольвентной системой, которую вы собираетесь использовать при выполнении этой процедуры. Это имеет решающее значение для получения желаемых волокон. Кроме того, не забудьте выбрать вращающуюся вентилируемую вытяжку или шкаф, чтобы обеспечить надлежащую экстракцию растворителей.