Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива

Этот метод может помочь в решении ключевого вопроса в области инженерии стволовых клеток, например, как клеточное микроокружение изменяет клеточные фенотипы и функции. Основным преимуществом данной методики является то, что она обеспечивает множественную искусственно созданную среду для клеток в одной пластине, которую невозможно выполнить обычным методом в микроконтактной пластине, демонстрируя эту процедуру техниками Коки Йошимото и Рисако Сакаи из нашей лаборатории. После создания 3D изображений масок для нановолоконных массивов и пресс-форм из микрофлюидных структур по текстовому протоколу.

Используйте 3D-принтер для печати масок и форм. Для приготовления полимерных растворов для электропрядения разбавляют 13-процентную жидкость PMGI с тетрагидрофураном до девяти процентов. Растворите 0,08 грамма ПС в соотношении ТГФ к диметилформамиду один к одному объему и используйте жидкий регент, чтобы довести объем до конечного одного миллилитра восьмипроцентного веса на объем раствора ПС.

Растворите 0,1 грамма ГТ в воде, кислотной кислоте и этилацетате и используйте смешанный раствор растворителя, чтобы довести объем до конечного одного миллилитра 10-процентного весового раствора ГТ. Затем, используя машину для магнетронного распыления, нанесите слой платины толщиной пять нанометров на полистирольную базовую пластину, которая служит катодом в электроспиннинговой установке. Загрузите каждый полимерный раствор в пятимиллилитровый шприц, оснащенный тупой иглой из нержавеющей стали 23 калибра.

Затем закрепите шприцы на шприцевом насосе на расстоянии 12 сантиметров от коллектора электровращающегося устройства. Подключите иглу шприца к высоковольтному источнику питания и установите его на 11 киловольт. Затем установите скорость откачки на 20 миллилитров в час и поддерживайте температуру и влажность на уровне 30 градусов Цельсия и менее 30 процентов по объему соответственно.

Теперь наденьте маску на опорную плиту. Затем через отверстия маски изготовьте нановолокна на опорной пластине с различной плотностью, изменяя время электровращения. Снимите маску с опорной пластины и повторите изготовление нановолокна.

Когда массив будет готов, поместите его в эксикатор при температуре 25 градусов Цельсия на 16 часов, чтобы испарить оставшийся растворитель. Чтобы сшить нановолокна GT, обработайте их 0,2 моляра EDC и 0,2 моляра NHS в этаноле. И инкубируйте образцы при температуре 25 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Чтобы промыть волокна GT nano, дважды используйте 99,5-процентный этанол и высушите пластины в вакууме при температуре 25 градусов Цельсия в течение 16 часов. Для изготовления микрофлюидных структур смешайте 2 грамма отвердителя PDMS и 20 граммов основы PDMS. Затем вылейте предварительную смесь PDMS на готовую форму.

В эксикаторе дегазируют предварительную смесь PDMS в течение 30 минут. Затем засушите предварительную смесь PDMS в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 16 часов. Чтобы собрать массивы Macme, снимите отвержденную структуру PDMS с формы и используйте 70-процентный этанол для ее очистки.

Затем разряжайте атмосферный коронный разряд на нижней стороне структуры PDMS. Быстрая сборка структуры PDMS с помощью нановолоконной матрицы. Затем в духовке выпекайте сборку при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух суток.

С помощью DPBS вымойте H9HESCs, выращенный на 35-миллиметровой посуде. Затем добавьте в блюдо 0,5 миллилитра рекомбинантной легкой протеазы трипсина и выдержите ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. Осторожно аспирируйте на надосадочной жидкости смесь протеазы.

Немедленно добавьте среду HPSC и аккуратно распределите среду по поверхности чашки несколько раз, чтобы диссоциировать клетки. Затем переложите отделенные клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку в 200 раз сильнее силы тяжести в течение трех минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и суспендируйте клетки в предварительно подогретой среде HPSC. Затем пипеткой впрыскивают по 12 микролитров клеточной суспензии в каждую микрофлюидную камеру. После флуоресцентного мечения клеток в соответствии с текстовым протоколом отклейте микрофлюидную структуру PDMS от матрицы Macme.

Затем удалите остатки PBMS из матрицы Macme, добавьте 90 процентов глицерина в PBS к окрашенным клеткам и наложите покровный лист. Наконец, установите пластину вверх ногами на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа. Используйте программное обеспечение для визуализации микроскопа для получения 12-битных цветных изображений.

Здесь представлены иммунофлуоресцентные изображения H9HPSC, культивируемых при высокой начальной плотности посева на желатиновых нановолокнах и окрашенных 3 клеточными фенотипическими маркерами. Анализ SOM был использован для преобразования многомерных многопараметрических наборов данных в низкоразмерные 2D-карты для сравнения однородности и гетерогенности уровней экспрессии для четырех фенотипических маркеров в каждом наборе данных, а также была выполнена неконтролируемая иерархическая кластеризация для узлов SOM. Как указано здесь, во всех группах наблюдалась более высокая экспрессия OCT4, чем наблюдалось на гелевой матрице базальной мембраны, или MG. Первая группа показала высокие сигналы EdU, что указывает на то, что большинство клеток активно пролиферировали.

Таким образом, микроокружения в первой группе были пригодны для поддержания HPSC, поскольку недифференцированные HPSC быстро размножаются при сокращении фаз межклеточного цикла. Во вторую группу вошли клетки, засеянные с недостаточной исходной плотностью, и клетки, выращенные на каркасах 2D GT, которые не поддерживали самообновление HPSC. Например, в этом образце был потерян сигнал EdU, а уровень аннексина V был немного повышен, что указывает на то, что клетки утратили свою стволовость и постепенно стали апоптотическими.

PMGI MidNF HighCD из третьей группы, которая представляет микросреды, составляющие нановолоконные матрицы PMGI, показал большие вариации сигналов OCT4 и EdU по сравнению с другими условиями. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области стволовых клеток к изучению тканевой инженерии и передового скрининга.