Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении протеопатической сидинговой активности рекомбинантных или биологических источников, что позволяет проводить чувствительный анализ белков, агрегатов и образцов. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области нейродегенерации. Например, каким образом можно количественно оценить изменения сидинговой активности после терапевтического вмешательства на животных моделях заболевания?

Преимущества данного метода включают высокую специфичность к низким уровням белковых агрегатов, исключительную избирательность, простоту использования и высокую пропускную способность. Сегодня эту процедуру продемонстрирую я вместе с соавтором Брэндоном Холмсом.

Для подготовки биологического исходного материала начните с взвешивания замороженной ткани мозга в одноразовой лодочке для взвешивания. Затем перенесите ткань в коническую пробирку, добавьте ледяной буфер для гомогенизации так, чтобы конечный объем раствора составлял 10%, и перенесите образцы на лед в холодную комнату. Далее настройте зонд индикатора соответствующим образом и промойте боковую и нижнюю части зонда.

Промойте наконечник индикатора трижды, как указано, протирая зонд между каждым раствором. Когда зонд будет готов, погрузите наконечник в гомогенизационный буфер одного образца и запустите соникацию, подавая в общей сложности 25 импульсов. Когда ткань полностью перейдет в суспензию, центрифугируйте гомогенат и перенесите супернатант в чистую пробирку.

Следите за тем, чтобы не повредить нёбо. Несмотря на наличие множества других методов гомогенизации, продабция является более предпочтительной для выделения небольшого количества протопатических семян из биологических образцов. Механическая диссоциация обеспечивает стабильное и эффективное разрушение тканей и последующее извлечение семян.

Затем разлейте супернатант по аликвотам и храните лизаты при температуре -80 °C. Для перепосева клеток биосенсора в стерильных условиях промойте каждую клеточную линию теплым PBS, после чего инкубируйте в течение трех минут с трипсином-EDTA. После открепления клеток остановите реакцию теплым культуральнымt средьи и немедленно перенесите клетки в коническую пробирку.

Центрифугируйте ресуспендированные клетки, перенося осадок в свежую среду. Затем подсчитайте количество клеток и приготовьте общую смесь (мастер-микс) с концентрацией клеток 3 500 000 клеток на 13 мл среды. С помощью многоканального дозатора медленно перенесите по 130 µL клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного плоского планшета для культивирования тканей, стараясь помещать наконечники дозатора в центр лунок, не касаясь дна планшета.

После посева клеток дайте им осесть в течение 10 минут при комнатной температуре, затем инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C, 5% carbon dioxide и относительной влажности не менее 80%. На следующий день, когда клетки биосенсора достигнут конфлюэнтности 60–65%, смешайте среду с пониженным содержанием сыворотки, реагент липосом и биологический исходный материал для создания комплексов для трансдукции. Затем с помощью дозатора внесите 20 µL комплекса для трансдукции по стенке каждой отдельной лунки с биосенсором и верните обработанные клетки в инкубатор еще на 24–48 часов перед сбором.

Необработанные клетки будут проявлять только диффузную флуоресценцию. Однако в клетках, обработанных материалом-затравкой tau, через один-два дня появятся яркие агрегаты. Для сбора клеток замените культуральную среду на 50 µL трипсина-ЭДТА, чтобы остановить реакцию. Через пять минут добавьте 150 µL охлажденной культуральной среды, затем немедленно перенесите клетки в 96-луночный планшет с круглым дном и центрифугируйте для осаждения клеток. Аспирируйте супернатанты, не задевая осадок, после чего осторожно, но тщательно ресуспендируйте клетки в 50 µL 2% паральдегида на 10 минут.

Затем снова центрифугируйте клетки и как можно быстрее ресуспендируйте осадки в 200 µL охлажденного буфера для проточной цитометрии. После фиксации поместите планшет в совместимый с FRET проточный цитометр и постройте график зависимости площади бокового рассеяния (side scatter area) от площади прямого рассеяния (forward scatter area) по вариантам. Затем, при запуске первой клеточной линии, отрегулируйте напряжение бокового и прямого рассеяния так, чтобы популяция клеток находилась в нижнем левом квадранте.

Затем с помощью инструмента «многоугольник» (polygon tool) определите популяцию клеток как гейт P1. Теперь создайте график зависимости высоты прямого светорассеяния от площади прямого светорассеяния (forward scatter height versus forward scatter area) в виде диаграммы с областями (variant plot) и примените гейт P1. Далее определите одиночные клетки как гейт P2 и постройте для каждого из них гистограмму.

Для фильтров C-F-P-Y-F-P и fret примените гейт P к двум-трем различным гистограммам (по одной для каждого из фильтров C-F-P-Y-F-P и fret) для проведения компенсации. Добавьте 30 µL суспензии клеточной линии один в 200 µL суспензии клеточной линии два. Затем нажмите на иконку настроек прибора, перейдите на вкладку компенсации и выберите «matrix», чтобы открыть таблицу компенсации.

Постройте график зависимости площади FRET от площади CFP по вариате и примените гейт P two. Затем, при активных cell line one и cell line two, нажмите на значок квадранта и начертите квадранты так, чтобы флуоресцентные отрицательные и положительные популяции были разделены двумя нижними квадрантами. Теперь создайте таблицу статистики, отображающую медианную интенсивность флуоресценции (MFI) FRET для гейтов LL three и LR three, и корректируйте параметр FRET в матрице компенсации до тех пор, пока значения MFI сигнала FRET для LL three и LR three не станут примерно равными.

Затем постройте график зависимости площади YFP от площади CFP с разделением на квадранты. Настраивайте параметр YFP в матрице компенсации до тех пор, пока MFI сигнала YFP в квадрантах не станет примерно равным. Это выполняется аналогично процедуре, описанной ранее для проточной цитометрии FRET.

Основное перекрытие флуоресценции происходит из-за излучения CFP в канал детекции FRET, что может быть исправлено с помощью компенсации флуоресценции с использованием контрольных клеток с одним положительным цветом. После установки всех гейтов и компенсации сигнала CFP выделите интересующие лунки и запустите анализ данных для остальной части планшета. Сначала определите популяцию клеток и одиночных клеток, используя те же параметры, которые мы настраиваем для проточного анализа.

Затем, используя клеточную линию три, постройте график одиночно положительных по YFP клеток в координатах FRET против YFP по варианту. Проведите полигональный гейт вдоль и в стороне от наклона популяции FRET-положительных клеток, чтобы определить гейт ложного FRET, который исключает перехлест YFP в фильтр FRET. После применения гейта ложного FRET ко всем образцам, постройте график клеток C-F-P-Y-F-P, обработанных пустыми липосомами, в координатах FRET против CFP по варианту и введите полигональный гейт вдоль наклона популяции, который направлен вверх и влево, в сторону от популяции.

Все события, попадающие в этот гейт, считаются положительными по FRET, а процент таких клеток будет коррелировать с титром посевного материала, использованным при обработке. Наконец, зафиксируйте интересующие параметры анализа, включая процент FRET-положительных клеток и медианную интенсивность флуоресценции (MFI) этих клеток. Затем вычислите произведение процента положительных клеток и MFI, чтобы вручную рассчитать интегральную плотность FRET.

В отсутствие агрегатов или «затравок» (seeds) тау-белок сохраняется в растворимом мономерном состоянии, что проявляется в виде стабильного диффузного и FRET-отрицательного флуоресцентного сигнала. После введения затравок тау-белка в клетки биосенсора эндогенный тау-белок переходит в агрегированное и FRET-положительное состояние, что фиксируется при количественном определении FRET. Анализ методом проточной цитометрии подтверждает, что для детектирования здесь достаточно фемтомолярных концентраций рекомбинантного тау-белка.

Ткань ствола мозга мышей с таупатией, забитых в разном возрасте, служит репрезентативным отделом мозга, демонстрирующим стабильное обнаружение сидинговой активности у животных уже в возрасте 1,5 месяцев. В данном эксперименте гомогенаты мозга субъектов с болезнью Альцгеймера проявили выраженную сидинговую активность, в то время как у контрольной группы соответствующего возраста и субъектов с болезнью Гентингтона такая активность отсутствовала, что подтверждает специфичность анализа к тау-агрегатам. Необработанные первичные нейрональные культуры, трансдуцированные лентивирусными конструкциями tau-CFP и tau-YFP, демонстрировали диффузный флуоресцентный сигнал при воздействии рекомбинантных тау-сидов.

Однако эндогенный tau образует крупные агрегаты, обнаруживаемые методом проточной цитометрии с FRET даже в отсутствие трансдукции, опосредованной липосомами. Если источники «затравок» (seeds) предварительно инкубируют с препаратами, ингибирующими захват tau, такими как гепарин, и обрабатывают в отсутствие липосом, активность инициирования агрегации, содержащаяся как в рекомбинантных fis, так и в образцах мозга мышей с таупатией, может быть заблокирована. После освоения метода.

Эту методику можно выполнить за три дня, при этом время непосредственной работы в лаборатории составит всего от одного до двух часов в день. При выполнении данной процедуры важно помнить, что некоторые этапы потребуют внутренней оптимизации. Например, при определении эффективных титров из патогенных семян из различных биологических источников.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как настраивать, проводить и анализировать эксперименты по FRET-проточной цитометрии с целью обнаружения протеопатической активности сидинга из рекомбинантных и биологических источников.