Чувствительный Обнаружение Proteopathic посев деятельности с FRET проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении протиопатической активности посева из рекомбинантных или биологических источников, что позволяет проводить чувствительное обнаружение белка, агрегатов и образца. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейродегенерации. Например, как мы могли бы количественно оценить изменения в активности посева после терапевтического вмешательства на животных моделях заболеваний?

К преимуществам данной методики можно отнести ее высокую специфичность по отношению к низким уровням белковых агрегатов. Его изысканная специфичность, простота использования и высокая пропускная способность. Демонстрировать эту процедуру сегодня буду я сам вместе с соавтором Брэндоном Холмсом.

Для приготовления биологического семенного материала начинают со взвешивания замороженной мозговой ткани в одноразовой сывороточной лодке. Затем переложите ткань в коническую трубку, добавьте ледяной гомогенизационный буфер, чтобы конечный раствор составил 10%, дождаться объема и перенесите образцы в холодное помещение на льду. Далее отрегулируйте щуп так, чтобы индикатор установил соответствующие настройки и промойте щуп в сторону и снизу.

Поэтому индикатор наконечника три раза, как указано, протирая щуп между каждым раствором. Когда зонд будет готов, погрузите наконечник в гомогенизационный буфер одного образца и запустите ультразвуковую обработку, выдающую 25 импульсов. Когда ткань полностью окажется во взвешенном состоянии, открутите гомогенат вниз и переложите супинат в чистую пробирку.

Следите за тем, чтобы не потревожить вкус. Несмотря на то, что существует множество других методов гомогенизации, пробация лучше всего подходит для выделения небольших количеств протиопатических семян из биологических образцов. Механическая диссоциация обеспечивает последовательное и эффективное разрушение тканей и последующую экстракцию семян.

Затем уложитесь в положение лежа на спине и храните лизаты при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы воспроизвести биосенсорные клетки в стерильных условиях, промойте каждую клеточную линию теплым PBS с последующей трехминутной инкубацией с трипсином ЭДТА. Когда клетки отделятся, следует прекратить реакцию теплой питательной средой и немедленно перенести клетки в коническую трубку.

Центрифугируйте ячейки ресус, суспензируя гранулу в свежей среде. Затем подсчитывают ячейки и делают мастер-микс разведение клеток из расчета 3 500 000 клеток на 13 миллилитров среды. С помощью многоканальной пипетки медленно перенесите 130 микролитров клеток в каждую лунку с плоским дном культуры ткани, обработанной 96-луночным планшетом, следя за тем, чтобы кончики пипеток располагались в центре лунок, не касаясь дна пластины.

После того, как клетки будут покрыты, дайте им спокойно отстояться в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и относительной влажности, превышающей или равной 80%. На следующий день, когда биосенсорные клетки слились на 60-65%, объедините восстановленную липосомальную среду сыворотки и биологический источник семян для создания трансдукционных комплексов. Затем нанесите пипеткой 20 микролитров трансдукционного комплекса вниз по боковой стороне каждой отдельной лунки биосенсора и верните обработанные клетки в инкубатор еще на 24-48 часов до сбора.

Необработанные клетки будут проявлять только диффузную флуоресценцию. Тем не менее, клетки, обработанные материалом семян тау, покажут яркие агрегаты Через один-два дня для сбора клеток замените среду для клеточной культуры 50 микролитрами триина ЭДТА, остановив реакцию. Через пять минут со 150 микролитрами охлажденной культуры, среду, немедленно перенесите клетки в 96 лунку круглой нижней пластины и гранулируйте клетки, аспирируйте S-надосадочную жидкость, не нарушая гранулы, а затем осторожно, но тщательно восстановите, суспендируйте клетки в 50 микролитрах 2%-ного паральдегида на 10 минут.

Затем снова раскрутите клетки и как можно скорее повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах охлажденного буфера для проточной цитометрии. После фиксации загрузите планшет на ладово-совместимый проточный цитометр и сгенерируйте область бокового рассеяния против области прямого рассеяния с помощью вариантного графика. Затем, запустив первую линию ячейки, отрегулируйте напряжение бокового рассеяния и прямого рассеяния, пока популяция клеток не окажется в нижнем левом квадранте.

Затем с помощью инструмента многоугольник определите популяцию клеток как походку P единицу. Теперь сделаем высоту прямого рассеяния в зависимости от площади прямого разброса с помощью вариантного графика и примените P один вентиль. Затем определите отдельные ячейки как походку P two и сгенерируйте по одной гистограмме каждая.

Для фильтров C-F-P-Y-F-P и фильтров ладов нанесите две-три разные гистограммы, по одной для фильтров C-F-P-Y-F-P и фильтров ладов для компенсации. Внесите 30 микролитров одной суспензии клеточной линии в 200 микролитров суспензии клеточной линии. Затем нажмите на значок настроек прибора, а затем перейдите на вкладку «Компенсация», и проверьте матрицу, чтобы открыть таблицу компенсаций.

Сгенерируйте площадь лада в зависимости от площади CFP с помощью вариативного графика и примените стрильгу P два. Затем, когда первая и вторая клеточные линии работают, щелкните значок квадранта и нарисуйте квадранты, такие как флуоресцентная отрицательная и положительная популяции разделены двумя нижними квадрантами. Теперь создадим таблицу статистики, которая отображает медианную интенсивность флуоресценции или MFI лада для вентилей LL три и LR три, и отрегулируем параметр лада в матрице компенсации до тех пор, пока MFI сигнала лада не станет примерно равным между LL три и LR три.

Затем создайте площадь YFP в сравнении с областью CFP с помощью вариативного графика с квадрантами. Корректируйте параметр YFP в компенсационной матрице до тех пор, пока MFI сигнала YFP не станет примерно равным между квадрантами. Аналогично показанному ранее для проточной цитометрии.

Первичный флуоресцентный побочный эффект происходит от CFP, излучаемого в канал обнаружения ладов, который может быть скорректирован с помощью компенсации флуоресценции с использованием одноцветных положительных контрольных ячеек. Выделите интересующие вас скважины и прогоните оставшуюся часть пластины для анализа данных. Во-первых, определите ячейки и отдельные ячейки, используя те же параметры, что и при настройке анализа потока.

Затем, используя третью линию клеток, построите одиночные положительные ячейки YFP в виде лада и YFP с помощью вариантного графика. Нарисуйте многоугольный вентиль, проходящий вдоль и в сторону от наклона популяции ладовых положительных клеток, чтобы определить ложную походку лада, которая исключает перетекание YFP в фильтр ладов. После применения ложной ладовой походки ко всем образцам нанесите обработанные пустыми липосомами C-F-P-Y-F-P клетки на лад в зависимости от CFP с помощью вариативного графика и введите полигональную ga вдоль наклона популяции, которая простирается вверх и влево от популяции.

Любые события, которые смещаются в эти ворота, считаются ладоположительными, и процент клеток будет коррелировать с титром семян, используемым во время лечения. Наконец, запишите интересующие параметры анализа, включая процент положительности ладов и медианную интенсивность флуоресценции ладоположительных клеток. Затем измерьте произведение процента положительности и MFI, чтобы вручную рассчитать интегрированную плотность ладов.

В отсутствие тау-агрегатов или семян тау поддерживается в растворимом мономерном состоянии, представленном постоянным диффузным и ладовым отрицательным флуоресцентным сигналом. После введения семян тау в биосенсорные клетки эндогенный тау преобразуется в агрегированное и положительное состояние количественного определения ладов. Последующий анализ проточной цитометрии подтверждает, что фемтомолярные концентрации рекомбинантного тау достаточны для обнаружения. Здесь.

Ткань ствола мозга мышей с таупатией, умерщвленных в разном возрасте, служит репрезентативной областью мозга, демонстрирующей последовательное обнаружение активности посева у животных уже в возрасте 1,5 месяцев. В этом эксперименте однородный мозг пациентов с болезнью Альцгеймера продемонстрировал устойчивую активность посева, в то время как контрольная группа соответствующего возраста и пациенты с болезнью Хантингтона не продемонстрировали специфичность анализа к тау-агрегатам необработанных первичных нейронных культур, трансдуцированных тау, CFP и тау. Лентивирусные конструкции YFP проявляли диффузный флуоресцентный сигнал при обработке рекомбинантными семенами тау.

Тем не менее, эндогенный тау образует большие агрегаты, обнаруживаемые с помощью проточной цитометрии даже при отсутствии липосомной трансдукции. Когда семена предварительно инкубируются с препаратами, которые ингибируют поглощение тау, такими как гепарин, и обрабатываются в отсутствие липосом, активность посева, содержащаяся как в рекомбинантных образцах мозга, так и в образцах мозга мышей таупатии, может быть заблокирована. После освоения.

Эту технику можно выполнить за три дня, при этом каждый день всего один-два часа работы на стенде. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что для выполнения определенных этапов потребуется внутренняя оптимизация. Например, при определении эффективных титров из протиопатических семян из различных биологических источников.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настраивать, проводить и анализировать эксперименты по проточной цитометрии с целью обнаружения протиопатической активности посева из рекомбинантных и биологических источников.