Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и анализе циркулирующих внеклеточных везикул в крови двумя различными методами. Для метода индивидуального детектирования внеклеточных везикул сначала из образца крови выделяют плазму с низким содержанием тромбоцитов (PPP).

Затем PPP окрашивают антителами, конъюгированными с соответствующими флуорохромами. При использовании метода детекции на основе микросфер внеклеточные везикулы инкубируют с микросферами, после чего связанные с ними везикулы окрашивают соответствующими конъюгированными с флуорохромами антителами. В конечном итоге содержание циркулирующих внеклеточных везикул можно определить путем анализа образцов методом проточной цитометрии.

Главным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как электронная микроскопия или сепарация с помощью магнитных частиц, является то, что он значительно быстрее и позволяет оценить общую популяцию внеклеточных экзосом, а не ограничиваться отдельными субпопуляциями. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как успех процедуры требует строгого соблюдения продемонстрированных манипуляций и параметров настройки цитометра. Для получения высококачественных данных с минимальной ежедневной вариабельностью начните с центрифугирования образцов цельной крови для отделения плазмы от лейкоцитарного слоя и эритроцитов. Затем перенесите аликвоты супернатанта плазмы объемом 1.2 mL в центрифужные пробирки объемом 1.5 mL, стараясь не затронуть нижние слои, содержащие лейкоцитарный слой и эритроциты, после чего повторно центрифугируйте супернатант для удаления тромбоцитов и крупных клеточных фрагментов.

По окончании центрифугирования осторожно перенесите все содержимое образцов БПП, кроме последних 200 µL, в новые пробирки, стараясь не задеть осадок. Затем перемешайте плазму путем несколькократного пипетирования и перенесите по 320 µL каждого образца в верхний ряд 96-луночного планшета. Для окрашивания образцов объедините антитела, необходимые для каждой из трех панелей, в отдельные центрифужные фильтрующие пробирки с порогом отсечения 0,22 µm и центрифугируйте их в центрифуге с фиксированным углом ротора при одной заданной скорости.

Когда все антитела пройдут через фильтр, добавьте соответствующее количество смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, как показано на рисунке. Затем с помощью многоканального дозатора перемешайте образцы PPP и перенесите по 100 µL каждого образца к антителам во втором ряду. После этого снова перемешайте образцы, замените наконечники и перенесите по 100 µL образца в каждую из следующих двух строк с антителами в соответствии с протоколом.

Для проведения эксперимента внутри бокса биологической безопасности добавьте по 220 µL PBS в каждую лунку с шестой по восьмую строку, затем инкубируйте планшет при температуре 4 °C в течение 30 минут. После этого, используя многоканальный пипетку с регулируемым расстоянием между носиками, перенесите содержимое каждой лунки в соответствующую центрифужную фильтрующую пробирку, не меняя наконечников.

Используйте 200 µL PBS из одного из рядов для промывки, чтобы промыть лунки, из которых только что были извлечены образцы. Затем перенесите промывочный раствор в те же центрифужные фильтры, в которые ранее были добавлены образцы PPP, и закройте их. После того как все окрашенные образцы PPP вместе с промывочными растворами будут перенесены, центрифугируйте их в центрифуге с фиксированным ротором.

После центрифугирования убедитесь, что на поверхности фильтров не осталось жидкости. Затем ресуспендируйте содержимое фильтров в 300 µL PBS и перенесите полученную суспензию в предварительно маркированные пробирки для немедленного анализа методом проточной цитометрии. Промывка окрашенных образцов с использованием центрифужных фильтров улучшает разделение фонового сигнала и сигналов положительных маркеров.

Однако важно отметить, что некоторые из более мелких внеклеточных везикул, включая экзосомы, могут пройти сквозь поры фильтра. Для анализа образцов сначала установите параметры напряжения прямого и бокового светорассеяния в логарифмический масштаб и выберите минимальные пороги, допустимые цитометром для каждого параметра. Затем, при прогоне пробирки с PBS, отфильтрованным через мембрану 0.22 µm, отрегулируйте эти значения напряжения до максимально возможных, при которых отсекается большая часть фонового шума. Далее прогоните пробирку с смесью микросфер размером 1 µm и меньше, и обведите популяцию микросфер гейтом на графике прямого светорассеяния по отношению к боковому, чтобы охватить все события в диапазоне до 1 µm.

Теперь установите низкую скорость потока цитометра и с помощью микросфер отрегулируйте ручку настройки скорости потока на цитометре до достижения желаемой частоты событий. Затем, используя пробирку с радужными флуоресцентными частицами, разведенными в PBS, зарегистрируйте 5 000 событий, записывая средние значения интенсивности для прямого светорассеяния (forward scatter), бокового светорассеяния (side scatter) и каждого цветового канала. После настройки всех параметров анализируйте каждый образец в течение ровно одной или двух минут. По завершении первого считывания каждой пробирки добавьте в каждый образец 20 µL 10% MP 40, после чего повторно считайте содержимое пробирок в течение того же промежутка времени; это позволит вычесть количество положительных событий, обнаруженных в лизированном образце за равный период времени.

Для детектирования внеклеточных везикул методом захвата на микросферах начните с двухкратного промывания непокрытых полистирольных микросфер диаметром 6 µm средой RPMI, после чего ресуспендируйте их в 2 mL той же среды. Затем добавьте по 6 000 микросфер в каждую новую пробирку для FACS: в пробирку отрицательного контроля добавьте 400 µL среды, а в остальные пробирки — 200 µL PPP или ультрацентрифугированных внеклеточных везикул (в зависимости от условий) и 200 µL среды. Доведите конечный объем в каждой пробирке до 400 µL.

Добавьте больше среды. Инкубируйте пробирки в течение ночи при температуре 4 °C на шейкере. На следующее утро промойте гранулы двумя миллилитрами среды.

Откачайте супернатант и заблокируйте неспецифическое связывание, добавив 400 µL 5% бычьего сывороточного альбумина; поместите образцы на шейкер при температуре 4 °C на три часа. Через три часа промойте гранулы еще в 2 mL среды и ресуспендируйте осадок в 100 µL свежей среды. Теперь отфильтруйте антитела и добавьте соответствующий объем отфильтрованного коктейля антител в каждую пробирку, а затем, после выдержки в течение 30 минут при 4 °C, промойте гранулы еще в 2 mL среды.

В этот раз ресуспендируйте осадки в 400 µL среды и немедленно проанализируйте образцы методом проточной цитометрии, настроив параметры прямого и бокового светорассеяния на самый низкий порог, допустимый цитометром, как было продемонстрировано ранее. Наконец, выделите популяцию синглетных микросфер и зарегистрируйте 2000 событий для каждого образца. Как показано на этих точечных диаграммах, для обнаружения внеклеточных везикул в образцах PPP можно использовать как индивидуальный метод детекции, так и метод на основе микросфер. В анализе индивидуальной детекции лизированный контроль используется для установки гейтов для соответствующего нелизированного образца.

Большинство событий должны попадать в гейт внеклеточных везикул. Например, на данном рисунке эти двухпараметрические диаграммы демонстрируют детекцию маркеров CD 1 0 8 A и CD 2 35 A, которые являются двумя маркерами эритроцитов, известными тем, что они сосуществуют на клетках. Как и ожидалось, более половины положительных событий среди внеклеточных везикул оказались положительными по обоим маркерам, тогда как на этих двухпараметрических диаграммах экспрессия двух маркеров на внеклеточных везикулах, которые, как известно, не сосуществуют на клетках, демонстрирует отчетливые раздельные положительные популяции при использовании метода детекции на основе микросфер.

Разделение между положительными и отрицательными популяциями отсутствует, и события появляются в квадрантах двойных положительных клеток, хотя обычно они не встречаются на одних и тех же типах клеток; это происходит из-за того, что оба типа внеклеточных везикул связываются с одной микросферой. Следовательно, данные, полученные этим методом, лучше всего анализировать с помощью гистограмм, наложенных на данные отрицательного контроля, при этом (после освоения метода) в образцах с микросферами будет наблюдаться явный сдвиг экспрессии маркера по сравнению с контролем. При правильном выполнении данная методика позволяет проанализировать 12 образцов крови с использованием трех панелей антител за три-четыре часа методом индивидуального детектирования или за полтора дня методом с использованием микросфер.

При выполнении данной процедуры важно соблюдать единообразие в обработке каждого образца, а также убедиться, что скорость потока цитометра и интенсивность флуоресценции были правильно настроены в начале каждого эксперимента в соответствии с параметрами предыдущего дня, особенно при анализе нескольких образцов в течение нескольких дней.