Экстракорпоральное модели физиологических и патологических кровотока с применением к расследованиям клеток сосудов Ремоделирование

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за влиянием различных патологий пульсирующего потока на эндотелиальные клетки. В пробирке. Это достигается путем предварительной химической обработки стеклянных стекол и покрытия их белком, чтобы обеспечить прикрепление клеток во время воздействия потока.

На втором этапе определяется индекс пульсации потока, что позволяет сравнивать поток in vitro со значениями, описанными в литературе. Следующие предметные стекла подключаются к проточной системе для измерения реакции клеток на патологии потока. Результаты показывают изменения в морфологии и экспрессии белков на основе профилей потока с использованием оптической микроскопии и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Основным преимуществом этой методики перед перистальтическим или пульсирующим насосом является возможность регулировать пульсацию потока в соответствии с имитацией больной или здоровой реакции. Это может помочь ответить на ключевые вопросы в области артериальных заболеваний. Для начала поместите новые стеклянные предметные стекла размером 75 миллиметров на 50 миллиметров на один миллиметр в чистую стеклянную тарелку для морилки.

Затем добавьте достаточное количество 20%-ного раствора серной кислоты, чтобы полностью погрузить стеклянные предметные стекла и инкубировать их в растворе кислоты на ночь на следующий день. Вымойте предметные стекла три раза, погрузив их в свежую деионизированную воду на пять минут каждый раз. После полоскания погрузите предметные стекла в ацетон на 30 минут, а затем на ночь в раствор 6% трех аминопропилтрикси селина в ацетоне.

Далее промойте предметные стекла три раза в чистом ацетоне в течение пяти минут, меняя ацетон после каждой стирки. Затем промывку трижды погружают в деионизированную воду в течение пяти минут, меняя деионизированную воду после каждой промывки. Затем погрузите предметные стекла в 1,5% глутаральдегид и оставьте их погруженными на 60 минут.

После сшивания дважды промойте предметные стекла в деионизированной воде, меняя деионизированную воду после каждой стирки, затем поместите предметные стекла в 70% этанол на 30 минут, чтобы стерилизовать их. Удалите этанол и дайте остаткам испариться со стекол. После высыхания увлажните предметные стекла, поместив их на короткое время в стерильную деионизированную воду.

Затем снимите держатель слайда и поместите его в квадратную чашку Петри размером 100 на 100 миллиметров. В ламинарном проточном колпаке функционализированное предметное стекло содержит один миллилитр раствора фибронектина с концентрацией 25 мкг на миллитр, покрывая приблизительную область, на которую будет воздействовать камера для клеточной культуры. Затем накройте чашку крышкой и инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов После инкубации аспирируйте оставшийся раствор и засейте 600 000 эндотелиальных клеток в одном миллилитре DMEM с 10% FBS на покрытую поверхность предметного стекла.

Накройте камеру крышкой, а затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 120 минут. Затем накройте клетки дополнительной средой и продолжайте инкубировать их до тех пор, пока они не слились на 70-80%. Подключите проточную цепь, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, и, как показано здесь, убедитесь, что демпфирующая камера и ультразвуковой расходомер расположены в правильном направлении потока.

Далее заполните поток, контур и резервуар деионизированной водой. Убедитесь, что выпускная труба резервуара погружена в объем резервуара. Затем визуализируйте форму волны потока с помощью расходомера.

Откройте клапан выпуска воздуха на демпферной камере, чтобы изменить соотношение объема жидкости и воздуха. Закройте клапан выпуска воздуха с разными интервалами между уровнями жидкости и рассчитайте индекс пульсации. Чтобы вычислить индекс, оцените форму волны потока, так как пик представляет максимальное значение VM.

Впадина представляет собой v min, а среднее V — среднее значение записи сигнала. Значения индекса пульсации в записной книжке. Отметьте полученный уровень жидкости и индекс пульсации на демпфирующей камере с помощью фломастера с перманентными чернилами для использования в будущем.

Определите желаемые уровни индекса пульсации по литературе по патологии, указанной в сопроводительном текстовом протоколе, при подготовке проточной камеры. DMEM с добавлением 1% FBS на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Выньте один из предметных стекол с покрытием из фильтрующего материала, когда они слились на 70-80%, и поместите прокладку поверх сидящей стороны ячейки.

Далее совместите вакуумный канал проточной камеры с отверстиями в прокладке. Затем прикрепите вакуумную трубку к вакуумным отверстиям, следя за тем, чтобы среда не просачивалась в вакуум. Поместите лист поликарбоната под стеклянное стекло и зажмите узел проточной камеры одним пружинным зажимом на каждой из коротких сторон и двумя пружинными зажимами вдоль длинных сторон проточной камеры.

Далее подсоедините проточную камеру, вход и выход к проточному контуру. Поместите проточную систему в инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, и заполните контур предварительно подогретым материалом, заполнив резервуар фильтрующим материалом и закачав его с низкой пульсацией. Поддерживайте этот поток в течение четырех часов, чтобы подготовить клетки.

Затем отрегулируйте объем жидкости в демпфирующей камере до предварительно отмеченного индекса пульсации и культуры. Ячейки на желаемую длительность. Показанные здесь эндотелиальные клетки культивировали без потока, с постоянным потоком и пульсирующим потоком.

Изменения в морфологии могут наблюдаться от типичной морфологии эндотелиальных клеток к морфологии, более веретенообразной после 24 часов воздействия высокого пульсирующего потока. В то время как статический и стационарный поток показывают незначительную разницу в морфологии или вообще не показывают ее. Гладкомышечные клетки также подвержены влиянию совместного культивирования с эндотелиальными клетками, подвергшимися воздействию высокого пульсирующего потока, на что указывают различные уровни альфа-актина гладкой мускулатуры и тяжелой цепи миозина.

При различных условиях потока клетки, которые подвергались воздействию пульсирующего потока, демонстрировали наибольшее количество обоих белков, что свидетельствует о гипертрофии и сократимости. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости поддерживать все уплотнения и следить за тем, чтобы уровень жидкости оставался постоянным после этой процедуры. Другие методы, такие как совместное культивирование эндотелиальных клеток, сосудистых клеток, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как межклеточные взаимодействия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собрать контур потока, контролировать индекс и подвергать эндотелиальные клетки воздействию пульсирующего потока.