Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы разделить сперматиды мышей на четыре отдельные популяции, что позволит проводить молекулярное изучение спермиогенеза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области зеркального воспроизведения, например, каково влияние хроматического моделирования на целостность генома. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает разделение сперматозоидов на популяцию чистых клеток без перекрестного загрязнения.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы наблюдали важные изменения интенсивности окрашивания DN во время ремоделирования хроматина в параметрах гапло за день до сортировки клеток. Добавьте от одного до двух миллилитров термоинактивированного FBS к пятимиллилитровому полипропиленовому круглому дну и 15 и 50 миллилитровым полипропиленовым коническим трубкам. Затем медленно покройте трубки путем ночной инверсии при четырех градусах Цельсия на ротаторе на следующий день.

Осторожно сцедите FBS с помощью пипетки P 200, чтобы удалить остатки FBS из пробирок объемом 15 и 50 миллилитров и оставить небольшой остаточный объем от 100 до 200 микролитров FBS в пятимиллилитровых пробирках для сбора очищенных клеток в день клетки. Сортируя, инкапсулированные тестовые образцы пропустите через мясорубку в 500 микролитров сортировочного буфера. Затем перенесите фрагменты ткани в пробирку объемом 1,5 миллилитра с помощью усеченного наконечника микропипетки.

Промойте половые клетки из семенных канальцев с помощью аккуратного пипетирования вверх и вниз с последующим промыванием неповрежденным кончиком. Затем используйте сетчатый фильтр 40 микрон для удаления мусора и комков, собирая фильтрат в конической пробирке объемом 50 миллилитров с покрытием FBS. Один раз промойте фильтр сортировочным буфером общим объемом до трех миллилитров и переведите фильтрат в коническую трубку с покрытием FBS объемом 15 миллилитров.

Затем добавьте 16 микролитров ЭДТА на миллилитр клеточной суспензии к клеткам и с помощью пипетки объемом 10 миллилитров медленно фиксируйте клетки в течение одной минуты тремя объемами ледяного холода, 100% этанола, в то время как при низкой скорости вортекса суспензия станет молочной после фиксации. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут с периодической инверсией. Затем центрифугируют клеточную суспензию, повторно суспендируют поддон в двух миллилитрах сортировочного буфера и окрашивают половые клетки четырьмя микролитрами cyto 16 DNAD непосредственно перед сортировкой.

Отфильтруйте элементы через фильтр 50 микрон в факсимильную трубку с покрытием FBS и тщательно промойте фильтр одним-двумя миллилитрами сортировочного буфера. Загрузите фиксированные зародышевые клетки в 488-нанометровый лазерный сортировщик клеток. Затем отобразите общее количество событий с помощью гистограммы, представляющей количество событий в области Alexa floor 4 88 и затвора положительных клеток окрашивания ДНК.

Затем отобразите ячейки из этого элемента в боковой области рассеяния против графика и элемента прямой зоны рассеяния. Ячейки, как показано, отображают эти стробируемые ячейки в области прямого рассеяния на фоне зоны Alexa floor 4 88, участка и ворот. Затем ячейки снова отображают эти ворота в виде отдельных этажей Alexa шириной 4 88 против площадных участков Alexa floor 4 88.

Спермиогенез проходит с 1 по 9 и с 10 по 12. Затем сперматиды могут быть закрыты для сортировки для сбора данных на этапах с 13 по 14 и с 15 по 16. Сперматиды отображают ячейки от первого вентиля в область прямого рассеяния на фоне графика EXOR 4 88 и вентиля.

Популяции клеток в соответствии с указаниями. Затем отобразите эти ворота в отдельных Alexa. Этаж 4 88 ширина против Alexa этаж 4 88 участок и ворота.

Шаги с 13 по 14 и с 15 по 16 сперматозоиды для сортировки. Наконец, соберите очищенные фракции по 100-200 микролитров FBS в отдельные FBS, покрытые пятимиллилитровыми трубками с круглым дном на льду. На этих изображениях показано пятнистое окрашивание потока, отсортированных пораженных популяций.

Этапы спермиогенеза от первого до девяти сперматид обычно демонстрируют ядра круглой формы, которые в спермиогенезе выглядят овальными. Сперматиды девятой ступени, которые наблюдаются в виде удлиненных крючков на этапах с 10 по 12. Сперматиды сперматиды на этапах спермиогенеза с 13 по 14 и с 15 по 16 демонстрируют ядра с аналогичной формой, но с несколько иной интенсивностью окрашивания ДНК, что позволяет идентифицировать эти различные популяции сперматид во время их сортировки с помощью проточной цитометрии.

Следуя продемонстрированному протоколу, можно ожидать, что чистота отдельных популяций S-клеток составит от 95 до 100%. Этот метод может быть выполнен за шесть-восемь часов. Если каждый шаг соблюдается правильно. Следует помнить, что клетки всегда должны оставаться на льду на протяжении всей процедуры, следуя этой процедуре, поскольку могут быть получены отдельные популяции сперматозоидов, обеспечивая достаточное количество материала для молекулярного анализа, такого как характеристика драматического процесса ремоделирования или для изучения генетического влияния этого перехода.