Биомиметические Материалы для характеристики Бактерии-хозяин взаимодействий

Общая цель этой процедуры заключается в получении биомиметических материалов, состоящих из чистых рекомбинантных адгезий, соединенных с гранулами полистирола, которые затем могут быть использованы для анализа биохимических и функциональных взаимодействий между отдельными бактериальными адгезиями и рецепторами клетки-хозяина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогенов хозяина, такие как измерение влияния на передачу сигналов клетками хозяина и ингибирование цитотоксичности, опосредованной патогенами. Основное преимущество этого метода заключается в том, что очищенные адгезии, АЭА, направлены и ковалентно связаны с полимерными частицами, которые по размеру похожи на бактерии и, таким образом, имитируют бактериальную поверхность.

Демонстрировать процедуру вместе со мной будет аспирант нашей лаборатории TU A-C-E-D-A. Здесь будет продемонстрирована направленная связь тал-амина. Этот протокол подходит для связывания цистинсодержащих белков с аминизированными функционализированными полимерными шариками с использованием сукцинила SUL для p-мели фенилбутирата, или SMPB. В качестве сшивающего агента подготовьте все необходимые реагенты непосредственно перед использованием, как описано в тексте протокола, чтобы начать процедуру активации гранул.

Перемешиваем бусинную суспензию, аккуратно переворачивая, а затем переливаем необходимое количество бусинной суспензии в стерильную 1,5-миллилитровую трубку. Содержащий один миллилитр стерильного PBS pH 7,0, аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы промыть шарики и гранулы путем центрифугирования в микроцентрифуге. Огромные аккуратно удаляют наст с помощью пипетки и рубец.

Риз суспендирует гранулы гранул в одном миллилитре свежего стерильного PBS и повторите этап промывки. Снова суспензируйте гранулу шарика. В 0,8 миллилитров PBS добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 10 миллимолярного SFO SMPB.

Чтобы получить концентрацию в два миллимоля, инкубируйте суспензию шариков в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия на вращающемся колесе, пока шарики инкубируются. Подготовьте белок для следующего этапа соединения, чтобы его можно было сразу добавить в активированные гранулы. Проверьте концентрацию белка и отрегулируйте ее до конечной концентрации, необходимой для реакции связывания. Шесть.

Для снижения белка обычно используются микромоляры белка и PBS объемом один миллилитр. Добавьте исходный раствор ТЭП, чтобы получить конечную концентрацию в пять миллимоляров. Инкубируйте раствор в течение 30 минут При комнатной температуре сохраните несколько микролитров белкового раствора для определения исходной концентрации белка и расчета эффективности связи.

Начните процедуру связывания белков с гранулирования активированных шариков и промывки гранулы. После одного миллилитра свежего, стерильного PBS повторно суспендируйте гранулу в приготовленном белковом растворе для придания нужной концентрации белка. Инкубируйте суспензию белковых бусин в течение двух часов при температуре 25 градусов Цельсия на вращающемся колесе Через два часа деактивируйте оставшиеся активированные группы на бусинах, добавив раствор Сикстины до конечной концентрации 50 миллимоляров, и инкубируйте до суспензии в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия на вращающемся колесе.

Удерживает бусины центрифугированием. Сохраняйте snat для определения концентрации белка и расчета эффективности сопряжения. Промойте гранулу гранулы дважды с одним миллилитром PBS и Resus bend и одним миллилитром свежего PBS для получения конечного продукта за сутки до проведения соревнований пробирного семенного материала в каждую лунку 24-луночного планшета с одним миллилитром хела клеток в концентрации 150 000 клеток на миллилитр.

Это позволит клеткам достичь примерно 80% беглости речи до начала эксперимента. Инокулируйте пятимиллилитровую морскую культуру LB свежей колонией гемолитика V para и выращивайте в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием. Приготовьте молекулу поливалентной адгезии в достаточном количестве, связанную с шариками, как было показано ранее.

Оставьте 100 микролитров 10 x бусин на лунку или конечную концентрацию 500 наномолярного белка в день проведения конкурсного анализа. Измерьте внешний диаметр 600 бактериальной культуры. Приготовьте инфекционную среду путем разведения бактериальных культур в бесцветный ДММ без добавок.

Подогреть до 37 градусов Цельсия, содержащую 10% объема взбитой суспензии. Чтобы получить MOI 10, приготовьте один миллилитр на лунку и от 10 до 20% избыточного объема на образец. Удалите из лунок старую среду и промойте культивированную.

Оздоровите клетки, добавив в каждую лунку по одному миллилитру стерильного PBS, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия. Удалите PBS и добавьте один миллилитр инфекционной среды на лунку. Добавьте растворы, содержащие контрольные гранулы и бактерии в качестве положительного контроля и адгезионных гранул, и не добавляйте бактерии в качестве отрицательных. Рычаги управления.

Добавьте цифровой мультиметр, содержащий 0,1% TRITTON X 100, в качестве контроля лизиса. Настройте каждое экспериментальное условие, включая контроль, в трех экземплярах. Инкубируйте планшет в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия в течение желаемого количества времени.

Оценивается цитотоксичность. Через четыре часа после заражения. Удалите 200 микролитров из каждой лунки, используемой в 24-луночной пластине, и переложите в новую 96-луночную пластину.

Вращайте 96-луночную пластину при 1500 G в течение пяти минут и перелейте по 100 микролитров из каждой лунки в свежую 96-луночную пластину. Добавьте 100 микролитров среды, использованной во время экспериментов по заражению, в три свежие лунки из 96-луночного планшета, которые будут использоваться в качестве заготовок. Проведите анализ высвобождения лактатдегидрогеназы с использованием набора для обнаружения цитотоксичности ЛДГ и в соответствии с инструкциями производителя.

Во-первых, рассчитайте необходимое количество реагента с шагом 25. Например, для 100 образцов. Смешайте 11,25 миллилитров реагента А с 250 микролитрами реагента В, инвертируйте во избежание образования пены, не завихрите.

Далее выложите смесь в резервуар. Затем добавьте по 100 микролитров смеси реагентов в каждый образец и инкубируйте планшет при комнатной температуре в 10, 20 и 30 минут. Считывание поглощения на 490 нанометрах на планшетном считывателе.

Впоследствии рассчитывают процент цитотоксичности, как описано в рукописи, измеряют адгезию бактерий через час после заражения. Удалите среду из клеточного слоя и тщательно промойте клеточный слой стерильным подогревом PBS, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Промыть не менее трех-четырех раз одним миллилитром PBS каждый раз лиз к клеткам-хозяевам, добавляя в каждую лунку по одному миллилитру стерильного раствора Triton X 100 в PBS, инкубировать планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Пипеткой проведите каждый образец вверх и вниз несколько раз, прежде чем перенести содержимое каждой лунки на отдельные 1,5 миллилитровые пробирки. Приготовьте десятикратное последовательное разведение образцов в стерильный PBS-планшет, по 100 микролитров каждого образца на морском LB-агаре и распределите с помощью разбрасывателя клеток, оптимизируйте разведение в планшете в зависимости от штаммов бактерий и временного момента для данной экспериментальной установки.

Разбавление в 10 раз в пятый раз или в 10 раз в шестой раз даст подходящее количество КОЕ. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в ночь на следующий день, перечислите бактерии путем подсчета колоний. В конкурентных анализах клетки пятки были инфицированы гемолитическим штаммом V para.

Слабый показан с положительным результатом или остался неинфицированным при наличии различных конкурирующих сущностей. Инфекция in vitro с бедной бусиной приводила к очень высокому уровню лизиса клеток, который ингибировался семью спаренными шариками MAM, но не MA'AM с одной парой или сопряженными шариками GST. Перечисление паралитиков v, прикрепленных либо к необработанным клеткам HELOC, либо к клеткам, инкубированным с MAM.

Семь контрольных бусин MAM one или GST показали, что MAM. Семь бусин, но не одна бусина MAM или контрольная бусина. Outcompete v para hemolytic для прикрепления к рецепторам поверхности клетки-хозяина.

Спайки, связанные с фтором. Четыре меченые бусины могут имитировать адгезию бактерий к клеткам-хозяевам и являются мощными инструментами для клеточной визуализации. Трубка справа содержит суспензию флуоресцентных синих биомиметических шариков. Мам.

Семь сопряженных флуоресцентных синих шариков были использованы для характеристики процесса опосредованного присоединения семи MAM к эпителиальным клеткам. Прикрепление семи MAM к клеткам-хозяевам приводило к перестройке актина и образованию стрессовых волокон, которые были совместно визуализированы с использованием Румина Фина для окрашивания на f-актин. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как аффинная очистка в сочетании с протеомикой или вестерн-блоттингом, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие клеточные факторы хозяина участвуют в процессах передачи сигналов после прикрепления бактерий.