Визуализация взаимодействия кишечной микробиоты и хозяина посредством флуоресцентной гибридизации In Situ , окрашивания лектина и визуализации

Этот упрощенный протокол детализирует рабочий процесс для обнаружения и изображения бактерий в сложных образцах тканей, от фиксации ткани до окрашивания микробов флуоресцентной гибридизацией in situ .

Микробы, связанные с хозяином, составляют эту очень сложную экосистему, которая действительно требует визуализации, чтобы быть понятой. И через эту частицу мы покажем вам, как пройти через процесс окрашивания и достичь визуализации интерфейса микробиома хозяина. Понимание биологии бактерий, связанных с хозяином, требует понимания их локализации в микросредах.

И этот метод позволит нам визуализировать отдельные таксоны в среде хозяина, а также в контексте других бактерий. С помощью этого метода можно будет определить, какие бактерии могли проникнуть через ткань хозяина, а также определить, могут ли быть истощены ключевые признаки, такие как слизь хозяина. Приготовьте свежий метакарн в совместимом контейнере с 60% абсолютного метанола, 30% хлороформа и 10% ледниковой уксусной кислоты.

Используя острые и чистые инструменты, отрежьте сегменты кишечника у мышей для визуализации. Сведите к минимуму максимальное нарушение образца и обработайте участки их гребнями, чтобы избежать воздействия на область изображения. Исправьте образец как можно скорее после рассечения, чтобы предотвратить деградацию.

Поместите участки кишечника в гистологические кассеты, деликатно удерживая край ткани пинцетом. Закройте кассету и полностью погрузите ее в свежий раствор метакарна, убедившись, что раствор не старше нескольких часов после погружения кассет. Для клинических образцов, которые будут собраны в клиническом кабинете без доступа к вытяжному шкафу, используйте полиэтиленовый контейнер для хранения с клапаном, вырезанным в крышке, который позволит проходить гистологические кассеты.

Заклеивайте эту заслонку, когда не проходите мимо образцов, чтобы предотвратить выход токсичных паров. Поместите парафин в термостойкий контейнер и расплавите в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение ночи. Промыть ткань, вылив жидкость в соответствующий сосуд для отходов и последовательно инкубируя ее в абсолютном метаноле, абсолютном этаноле и ксилоле, как описано в текстовой рукописи.

Слегка откройте кассеты, чтобы парафин вошел без потери сегментов ткани, используя двойные перчатки или пинцет. Погрузите и закройте кассеты в емкость с расплавленным парафином. Поместите контейнер обратно в духовку с температурой 60 градусов цельсия, убедившись, что кассеты заполнены парафином и не осталось больших пузырьков воздуха.

После инкубации в течение двух часов выньте емкость из духовки. Используя щипцы, аккуратно извлеките кассеты. Разогрейте духовку до 60 градусов Цельсия и предварительно разогрейте банку Коплина.

Добавьте достаточное количество ксилола в стеклянную бутылку, чтобы дважды покрыть стеклянные слайды в банке, и поместите парапленку вокруг крышки, чтобы предотвратить испарение ксилолов. Позвольте температуре ксилолов достичь 60 градусов по Цельсию. Подготовьте решение гибридизации FISH, как указано в рукописи текста.

Поместите слайды в банку Coplin, следя за тем, чтобы секции не соприкасались с другими слайдами или банкой, и выпекайте слайды при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. В вытяжном шкафу наполните банку Coplin предварительно расплавленными ксилолами из духовки, следя за тем, чтобы не вылить непосредственно поверх образцов и потенциально не выбить ткани. Поместите банку Coplin обратно в духовку с температурой 60 градусов.

Налейте использованные ксилолы в надлежащий контейнер для отходов, заботясь о том, чтобы не потревожить участки тканей на стеклянных слайдах и используя пару щипцов, чтобы слайды не выпали из банки Коплина. Наполните банку Коплина оставшимися ксилолами и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Инкубировать срезы в 99,5% этаноле в течение пяти минут при комнатной температуре.

После инкубации извлеките слайды из банки Coplin. Протрите заднюю часть слайдов лабораторной салфеткой или бумажным полотенцем и ненадолго высушите на воздухе, пока капли этанола не исчезнут. Создайте очень тесные круги вокруг каждого участка ткани, используя блокатор жидкости или ручку PAP, чтобы ограничить площадь расширения, необходимую для покрытия раствором гибридизации, избегая контакта чернил с секцией.

Подготовьте гибридизационный раствор и добавьте 0,5 мкг зонда на каждые 50 микролитр используемого раствора. Пипетка раствора на секции на слайде. Наложите на секцию гибкие пластиковые крышки, гарантируя, что объем используемой жидкости покрывает весь участок.

Создайте влажную камеру с наконечником пипетки с салфетками или бумажными полотенцами, которые были пропитаны избыточным гибридизационным раствором или PBS для обеспечения влажности. Инкубируйте слайд во влажной камере при температуре от 45 до 50 градусов Цельсия в течение не менее трех часов в зависимости от набора зонда для уменьшения испарения. Снимите пластиковые крышки и высиживайте слайды в буфере для промывки FISH в банке Coplin, предварительно расплавленной до 50 градусов цельсия.

Поместите банку Coplin обратно в духовку с температурой 50 градусов Цельсия на 10-20 минут. Извлеките буфер промывки FISH и замените его PBS в банке Coplin. Сразу после заправки банки Coplin PBS декантируйте PBS.

Снимите слайды из банки и выпейте контрразмах сверху всей секции, при этом убедитесь, что ткань не касается кончиком пипетки. Инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение 45 минут. Вымойте пятна три раза быстро свежим PBS.

Протрите заднюю часть слайдов о салфетку или бумажное полотенце и дайте большей части PBS испариться с секций с помощью вакуумной линии, подключенной к наконечнику пипетки. Монтируйте секции с помощью монтажного носителя. Прикрепите обшивки к слайду, покрасив по краям обшивки прозрачным лаком для ногтей, стараясь держаться подальше от края слайда.

Дайте ему установить комнатную температуру. Здесь показаны изображения дистальной толстой кишки мыши, моноколонизированной Muribaculum intestinale, и биколонизированной Muribaculum intestinale и Bacteroides thetaiotaomicron. Образцы были окрашены зондом FISH с тремя основными цианинами-3, помеченными специфическими для изолята Muribaculum, а также контрокрашенными с родамином-связанным лектином UEA-1 и DAPI.

Изображения участков, окрашенных цианином-3 FISH, DAPI и комбинированными каналами цианин-3 FISH и DAPI, показывают локализацию Muribaculum intestinale. Все сигналы DAPI в форме бактерий и размером с бактерию маркируются цианином-3 в состоянии моноколонизации. В состоянии биколонизации, в дополнение к этим двойным положительным клеткам цианина-3 и DAPI, есть окрашенные DAPI бактериальные клетки, которые, как и ожидалось, отрицательны на цианин-3.

За исключением более длинных нитевидных бактерий, более крупные DAPI-положительные структуры являются растительным материалом или ядрами из клеток-хозяев. Сегмент кишечника, который был разделен на глубине, которая обеспечивает вид просвета, а также продольные виды эпителия и сегмент мелкого сечения, раскрывающий только поперечные сечения крипт и отсутствие постоянного слоя слизи или бактерий, доказывает, что мелкое сечение не обеспечит просветные срезы кишечника. Неравномерное покрытие тканей или обшивки приводит к размытому и неравномерно освещенному сканированию плитки.

Пример нормального фона и высокого фона также показан здесь. По мере того, как мы узнаем больше о микробиоте, становится действительно очевидным, что объемных анализов, таких как секвенирование, недостаточно, чтобы действительно определить, что происходит между различными микробными видами и как они взаимодействуют друг с другом. И для этого нам действительно нужна визуализация.

Этот тип метода позволил сделать некоторые действительно важные открытия, например, что лишение клетчатки из рациона вызывает истончение слоя слизи и потенциальное заражение патогенами, такими как исследования из группы Мартинса, а также исследования последствий осмотической диареи и того, как истощение слоя слизи действительно влияет как на хозяина, так и на микробиоту. И это были исследования, проведенные группой Зонненберга, а также нашей группой.