Протоколы для анализа роли Paneth клеток для регенерации мышиной кишечника с помощью условных Cre-LOX Mouse Модели

Общая цель этой процедуры вскрытия состоит в том, чтобы продемонстрировать, как изолировать и подготовить кишечник мыши к последующим методам характеризации. Этот метод может быть использован для исследования способности кишечных стволовых клеток повторно заселять кишечник после экспериментальной процедуры. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ее можно использовать после любой методики или любой процедуры или после генной манипуляции Использование технологии cray locks Начните с помещения усыпленной взрослой мыши в положение лежа на спине и смачивания шерсти 70% этанолом.

Затем с помощью ножниц вскройте внутрибрюшинную полость в продольном направлении по средней линии и закрепите живот щипцами. Далее разорвите соединение с пищеводом и аккуратно потяните за желудок, чтобы удалить тонкую кишку вплоть до аппендикса. Затем аккуратно потяните за аппендикс, чтобы удалить толстую кишку вплоть до анального отверстия.

После того, как кишечник будет изолирован, удалите желудок в аппендиксе и с помощью шприца, оснащенного наконечником пипетки с тупым концом, промойте кишечник PBS сразу после промывки, разрежьте кишечник на три равных по размеру, проксимальный, средний и дистальный отделы. Затем разрежьте каждый участок на кусочки по одному сантиметру и поместите три-пять фрагментов ткани на середину куска хирургической ленты размером два на два сантиметра. В пирамидальной формации, когда все ткани прикреплены, запечатайте ленту вокруг частей в продольном направлении, создав сваю бревен.

Затем поместите ленту в емкость с плоским дном, содержащую по меньшей мере в 10 раз больший объем нейтральной, буферной, формальной и фиксирующей по отношению к объему ткани, и храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия до встраивания и разрезания. После фиксации немедленно после промывки перенесите ткань в емкость с плоским дном, содержащую по меньшей мере в 10 раз больше объема 70% этанола по сравнению с объемом ткани для фиксации ткани в Метконе. Разрежьте кишку на три части одинакового размера, как показано только что на рисунке.

Затем поместите каждую секцию рядом друг с другом на лист фильтровальной бумаги размером 15 на 15 см и с помощью пружинных ножниц раскройте секции на FOSS, когда все секции будут разделены. Переложите фильтровальную бумагу в стеклянную чашку со свежеприготовленным Метконом на срок от трех до 24 часов при комнатной температуре в конце фиксации, используйте щипцы, чтобы захватить конец каждого из кусочков кишечника по одному, и обмотайте ткани вокруг щипцов, чтобы сформировать отдельные швейцарские рулоны. Закрепите каждый валик, слегка приоткрыв щипцы и введя иглу 25 калибра через ткань.

Затем поместите свернутые ткани в емкость с плоским дном, содержащую, по меньшей мере, в 10 раз больший объем нейтральной буферной формулы и фиксирующую в качестве тканей, по меньшей мере, на один час перед обработкой для полной вялой визуализации тканевого взрыва. В 15-сантиметровые чашки Петри налить расплавленный сырой воск, смешанный с минеральным маслом. Затем сразу после промывания кишечника ледяным PBS промывают ткани 25 миллилитрами ледяного экскаль фиксатора.

После фиксации разрежьте кишечник на три-пять равных участков и поместите каждый участок на одну из остывших восковых пластин. Приколите каждый конец так, чтобы срезы были слегка растянуты брыжеечными линиями в верхней части пластин. Обрежьте излишки брыжейки.

Затем с помощью пружинных ножниц с бантом разрежьте внутренности в продольном направлении, когда они открываются, когда все секции были приколоты. Налейте на пластины достаточное количество фиксатора xal, чтобы покрыть все ткани по крайней мере через час при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки или шприца объемом 25 миллилитров удалите фиксатор и промойте ткани один раз 30 миллилитрами PBS.

Затем залейте секции 30 миллилитрами объединительного раствора DTTD на 30-60-минутную инкубацию при комнатной температуре с укачиванием. По окончании инкубации удалите обожествляющий раствор с помощью пипетки или шприца объемом 25 миллилитров, и залейте ткани еще 30 миллилитрами PBS. Затем с помощью задней пипетки удалите слизь с PBS после промывания.

Замените PBS на 30 миллилитров xal для ночного пятна при комнатной температуре в темноте с легким взбалтыванием на качающейся платформе на следующее утро. Если на срезах образовалось сине-зеленое пятно, замените xal на 30 миллилитров PBS. После трех минут легкого перемешивания сделайте швейцарские рулеты, как только что показано, и поместите салфетки в сосуд с плоским дном с широким горлышком, содержащий по меньшей мере в 10 раз больше соответствующего фиксатора, чем объем ткани при четырех градусах Цельсия, по крайней мере, за 24 часа до заделки и разрезания.

С помощью условного репортера ROSA 26 R Laxy через три дня после индукции в тонком кишечнике можно наблюдать 100% рекомбинацию с использованием ДНК, выделенной из рекомбинированных кроваток. КПЦР для рекомбинированных аллелей продемонстрировала незначительное увеличение рекомбинации в системе VI складки, возможно, из-за того, что рекомбинация в клетках панета не наблюдалась. Используя систему ah crease с использованием слабого репортера, обе системы также продемонстрировали полную потерю рекомбинированных клеток через три дня после индукции.

Данные о митозе и высоте клеток крипты K указывают на то, что система ah H Cree может восстановиться, предположительно за счет повторного заселения необъединенными кишечными стволовыми клетками. В противоположность этому, злодей Кри не смог восстановиться, несмотря на сохранение эпителиальных клеток крипты. Кроме того, склепные клетки у мышей vi Cree Cantin B были непролиферативными и не имели экспрессии маркера кишечных стволовых клеток.

ЭМ четыре. В отличие от крипт у мышей ahcre, клетки ПТГ подвергались апоптозу после делеции Caden b только в системе VI Cre. После освоения этой техники ее можно освоить примерно за 10 минут.

Важно свести к минимуму задержки, чтобы предотвратить деградацию тканей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как удалить кишечник у мыши для последующего анализа.