Легкий управляемый Ферментативный Декарбоксилирование

Общая цель данного эксперимента заключается в инициировании ферментативных реакций с помощью видимого света. В данном подходе свет используется для преобразования жирных кислот в терминальные алкины в мягких условиях реакции. Декарбоксилирование требует разрыва связей CC.

Эта связь очень стабильна, что делает данную реакцию крайне затруднительной. Использование света представляет собой экологически устойчивый подход к осуществлению столь сложной реакции. Идея этого метода возникла у нас, когда мы попытались добавить перекись водорода непосредственно в реакционную смесь, что привело к инактивации ферментов.

Основным преимуществом данной методики является обеспечение постоянного притока перекиси водорода. Сначала мы использовали очищенный OleT для светоиндуцированного биокатализа с целью характеристики нашего фермента. Впоследствии мы также протестировали неочищенный экстракт, что имеет важное значение для разработки промышленного применения.

После клонирования синтетического гена OleT в экспрессионный вектор и трансформации плазмиды в E.Coli, как описано в текстовом протоколе, инокулируйте клетки в две пробирки, содержащие по 3 мл среды LB с 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте прекультуры в шейкере в течение 15 часов. Перенесите по 2 мл культуры в две колбы объемом 1 л, содержащие 200 мл среды LB с ампициллином.

Инкубируйте колбы в шейкере при 37 degree celsius и 180 RPM до достижения культурами оптической плотности при 600 nanometers в диапазоне от 0.6 до 0.8. Затем добавьте в культуры 0.5 millimolar delta aminolevulinic acid. После этого индуцируйте клетки, добавив в колбы tetracycline в концентрации 0.2 micrograms per milliliter.

Инкубируйте культуры в течение 15 часов при 20 degree celsius и 180 RPM. После индукции перелейте культуры в центрифужные пробирки и центрифугируйте их при 12000 times G и four degree celsius в течение 20 минут. Удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадки, перенося их пипеткой в 50 миллилитров ледяного Трис-буфера, и перенесите суспензию в коническую центрифужную пробирку. Затем центрифугируйте при 4000 ×g и четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в трех миллилитрах буфера путем многократного пипетирования.

Лизируют клетки путем соникации тремя 30-секундными циклами с одноминутным перерывом между циклами. Затем центрифугируют лизат при 15000 ×g и 4 °C в течение 20 минут, после чего осторожно переносят бесклеточный экстракт в конические центрифужные пробирки с помощью пипеток. Для подготовки грубого экстракта для светозависимого биокатализа переносят 3 mL бесклеточного экстракта в центрифужный фильтр с порогом отсечения 10 kDa и центрифугируют при 4000 ×g при 4 °C для удаления низкомолекулярных соединений.

Рεσпендируйте белок в трех миллилитрах Tris. Для характеристики активности OleT в процессах светозависимого биокатализа белок необходимо очистить. Для начала очистки белка нанесите три миллилитра безклеточного экстракта на уравновешенные спин-колонки с никель-NTA.

Герметично закройте колонки с помощью нижних пробок и винтовых крышек. Слегка встряхните их до равномерного распределения смолы. Затем инкубируйте колонки в шейкере с перемешиванием.

Затем центрифугируйте колонку. Далее промойте колонки, добавив один миллилитр промывочного буфера, и центрифугируйте их при 700 ×g в течение двух минут. Повторите промывку еще дважды.

После промывки поместите колонки в конические центрифужные пробирки и добавьте в каждую колонку один миллилитр элюирующего буфера. Центрифугируйте пробирки при 700 ×g в течение двух минут и повторите элюцию еще дважды. Перенесите объединенные экстракты из колонок в центрифужный фильтр с пределом отсечения 10 kilodalton и центрифугируйте при 4000 ×g и 4 °C, чтобы отделить имидазол, использованный для элюции, от фермента.

В завершение определите чистоту и концентрацию белка, как указано в текстовом протоколе. Для начала процедуры биотрансформации сначала добавьте 10% поверхностно-активного вещества, такого как tergitol, и 28.4 milligrams стеариновой кислоты в дистиллированную воду, чтобы приготовить 10 milliliters 10 millimolar стокового раствора. Нагревайте раствор в нагревательной камере при 60 degrees celsius до полного растворения стеариновой кислоты.

Используйте данный раствор для приготовления реакционной смеси согласно следующему протоколу. Добавьте FMN, EDTA, буфер и стеариновую кислоту в две прозрачные стеклянные пробирки и перемешайте на водяной бане при 25 °C. Затем добавьте в пробирки очищенный фермент или неочищенный экстракт в концентрации 200 µg/mL.

Освещайте их прозрачной светодиодной лампой с расстояния двух сантиметров. Затем отберите пробы объемом 200 microliter в определенные моменты времени в пробирки, предварительно наполненные 20 microliters 37% соляной кислоты, для остановки реакций. После этого добавьте в каждую пробу пять microliters 10 millimolar раствора миристиновой кислоты в качестве внутреннего стандарта.

Для анализа продуктов реакции дважды добавьте в пробирки по 500 µL этилацетата. Переверните пробирки для перемешивания и центрифугируйте в течение одной минуты при 13 000 ×g. Затем перенесите по 400 µL супернатантов в микроцентрифужные пробирки и полностью выпарите их, аккуратно обдувая пробирки сжатым воздухом. Добавьте в пробирки по 200 µL MSTFA.

Инкубируйте смесь при 60 °C в течение 30 минут для дериватизации образцов перед анализом. Проанализируйте продукты реакции, введя пробу объемом 4 µL в газовый хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором, используя температурный профиль, описанный в текстовом протоколе. Затем определите соотношение гептадекана и β-гидроксикислоты, образовавшихся в каждом реакционном образце, с помощью газового хроматографа, сопряженного с масс-спектрометром.

Используйте температуру печи и настройки масс-спектрометра, описанные в текстовом протоколе. Введите один микролит каждого образца в газовый хроматограф и запишите хроматограмму. В завершение проконтролируйте хроматограммы ГХ-МС для каждого образца и проанализируйте их в соответствии с протоколом производителя.

Молекулярные массы продуктов ферментативных реакций определяли с помощью газового хроматографа, сопряженного с масс-спектрометром. Для жирных кислот с более длинными ацильными цепями фермент OleT преимущественно катализирует их декарбоксилирование с образованием олефинов различной длины. Образцы реакции биотрансформации анализировали на газовом хроматографе, оснащенном пламенно-ионизационным детектором.

Было показано, что декарбоксилирование стеариновой кислоты протекает в три раза быстрее, чем реакция гидроксилирования, при этом 99% стеариновой кислоты превращается в смесь гептадекана и 2-гидроксистеариновой кислоты в соотношении 3,3:1. После освоения метода светоиндуцированный биокатализ может быть осуществлен за несколько часов при условии правильного выполнения процедуры. Основная задача светового катализа заключается в связывании полезных реакций с процессом захвата света.

В нашем случае в качестве фотосенсибилизатора используется свет внутри молекулы FMN, которые связываются с нашим ферментом через молекулу-переносчик, которой является перекись водорода.