Легкий управляемый Ферментативный Декарбоксилирование

Общая цель этого эксперимента — запустить ферментативные реакции с использованием видимого света. При таком подходе свет используется для превращения жирных кислот в концевые алкины в условиях мягкой реакции. Декарбоксилирование требует разрыва CC-связей.

И эта связь очень стабильна, что делает эту реакцию очень сложной. Использование света является устойчивым подходом к достижению такой сложной реакции. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы попытались добавить перекись водорода непосредственно в реакцию, что привело к инактивации ферментов.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает постоянное количество перекиси водорода. Сначала мы использовали очищенный OleT для биокатализа под действием света, чтобы охарактеризовать наш фермент. Позже мы также протестировали сырой экстракт, который был важен для разработки промышленного применения.

После клонирования синтетического гена OleT в экспрессирующий вектор и трансформации плазмиды в E.Coli, как описано в текстовом протоколе, инокулируйте клетки в две пробирки, содержащие три миллилитра среды LB с концентрацией 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубируйте прекультуры в шейкере в течение 15 часов. Разведите два миллилитра культуры в 200 миллилитрах ЛБ с ампициллином в двух литровых колбах.

Инкубируйте колбы в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия и 180 оборотах в минуту до тех пор, пока культуры не достигнут оптической плотности на 600 нанометрах в диапазоне от 0,6 до 0,8. Далее добавьте в культуры 0,5 миллимоляра дельта-аминолевулиновой кислоты. А затем индуцировать клетки, добавив в колбы тетрациклин в дозе 0,2 микрограмма на миллилитр.

Инкубируйте культуры в течение 15 часов при температуре 20 градусов Цельсия и 180 об/мин. После индукции сцеживайте культуры в центрифужные пробирки и центрифугируйте пробирки при температуре 12000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулы пипетированием в 50 миллилитрах ледяного буфера Tris и перенесите суспензию в коническую центрифужную трубку. Продолжайте центрифугирование при 4000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в трех миллилитрах буфера путем повторного пипетирования.

Лизируйте клетки с помощью ультразвука с тремя 30-секундными циклами с паузой на одну минуту между циклами. Затем центрифугируйте лизат при температуре 15000 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, а затем осторожно пипетируйте экстракт без клеток в конические центрифужные пробирки. Для приготовления сырого экстракта для биокатализа с помощью света переведите три миллилитра одного бесклеточного экстракта в центрифугу емкостью 10 килодальтон и центрифугуйте при 4000-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия для удаления мелких молекул.

Ресуспендируйте белок в трех миллилитрах Триса. Чтобы охарактеризовать активность OleT в биокатализе, вызванном светом, белок необходимо очистить. Чтобы начать очистку белка, загрузите три миллилитра бесклеточного экстракта в уравновешенные спиновые колонки с никелевым NTA.

Загерметизируйте колонны нижними заглушками и завинчивающимися крышками. И слегка встряхните их, пока смола не распределится равномерно. Продолжайте инкубировать колонны в верхнем вибростенде.

Затем центрифугируйте колонку. Далее вымойте колонки, добавив один миллилитр промывочного буфера и центрифугируя их при 700-кратном G в течение двух минут. Повторите стирку еще дважды.

После промывки поместите колонки в конические центрифужные пробирки и добавьте в каждую колонку по одному миллилитру элюирующего буфера. Центрифугируйте пробирки при 700 умноженных на G в течение двух минут и повторите элюирование еще дважды. Добавьте комбинированные экстракты в колонке в фильтр центрифуги мощностью 10 килодальтон и центрифугируйте его при температуре 4000 раз G и четырех градусах Цельсия, чтобы отделить имидазол, используемый для элюирования, от фермента.

Наконец, определите чистоту и концентрацию белка, как указано в текстовом протоколе. Чтобы начать процедуру биотрансформации, сначала добавьте 10% поверхностно-активного вещества, такого как тергитол, и 28,4 миллиграмма стеариновой кислоты в дистиллированную воду, чтобы получить 10 миллилитров 10 миллимолярного исходного раствора. Нагрейте раствор в нагревательной камере при температуре 60 градусов Цельсия до полного растворения стеариновой кислоты.

Используйте этот раствор для приготовления реакционной смеси согласно следующему протоколу. Добавьте FMN, ЭДТА, буфер и стеариновую кислоту в две прозрачные стеклянные трубки и перемешайте на водяной бане при температуре 25 градусов Цельсия. Продолжайте, добавив в пробирки 200 микрограммов на миллилитр очищенного фермента или сырого экстракта.

И освещайте их прозрачной светодиодной лампочкой на расстоянии двух сантиметров. Затем возьмите 200 микролитров образцов в определенные моменты времени в пробирках, предварительно заполненных 20 микролитрами 37% соляной кислоты, чтобы остановить реакции. Затем добавьте пять микролитров 10 миллимолярного раствора миристиновой кислоты в каждый образец в качестве внутреннего стандарта.

Для анализа продуктов реакции дважды добавляют в пробирки 500 микролитров этилацетата. Переверните пробирки, перемешайте их и центрифугируйте в течение одной минуты при 13 000 раз по Г. Затем переложите 400 микролитров надосадочной жидкости в микроцентрифужные пробирки и полностью испарите их, осторожно обдувая пробирки сжатым воздухом. Добавьте в пробирки 200 микролитров MSTFA.

И инкубируйте смесь при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы дериватизировать образцы перед анализом. Анализ продуктов реакции путем введения образца объемом четыре микролитра в газовый хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором, с использованием температурного профиля, описанного в текстовом протоколе. Далее определяют соотношение одного гептадекана и бета-гидроксикислоты, образующейся в каждом реакционном образце, с помощью газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром.

Используйте температуру духовки и настройки масс-спектрометра, как описано в текстовом протоколе. Введите по одному микролитру каждого образца в газовый хроматограф и запишите хроматограмму. Наконец, контролируйте хроматограммы GCMS для каждого образца и анализируйте их в соответствии с протоколом производителя.

Молекулярные массы продуктов ферментативных реакций определяли с помощью газового хроматографа, соединенного с масс-спектрометром. Для жирных кислот с более длинными ацильными цепями фермент OleT преимущественно катализирует их декарбоксилирование до олефинов разной длины. Образцы реакции биотрансформации анализировали с помощью газового хроматографа, оснащенного пламенно-ионизационным детектором.

Было показано, что декарбоксилирование стеариновой кислоты происходит в три раза быстрее, чем реакция гидроксилирования, при этом 99% стеариновой кислоты преобразовано в смесь 3,3:1 одного гептадекана в 2-гидроксистеариновую кислоту. После того, как я освоюсь, биокатализ под действием света может быть выполнен за несколько часов, если, скажем, я буду работать правильно. При катализе света задача состоит в том, чтобы связать полезные реакции с урожаем света.

В нашем случае у нас есть свет внутри молекулы FMN в качестве фотосенсибилизатора и мы связываем их с нашим ферментом через молекулу переноса, которая является перекисью водорода.