Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Общая цель данного метода заключается в идентификации, характеристике и изоляции клеток из многоклеточного органоида в зависимости от стадии клеточного цикла и их расположения внутри органоида по сравнению с 2D-культурой клеток. 3D-модель OID воспроизводит биологию рака in vivo, так как она имитирует архитектуру опухоли и ее микроокружение. Благодаря сочетанию метода сфероидов с проточной цитометрией и методами визуализации данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области онкологии, такие как влияние микроокружения опухоли на чувствительность к препаратам, подвижность и пролиферацию клеток.

Основным преимуществом данного метода является возможность визуализации клеточного цикла в режиме реального времени, а также возможность очистки живых клеток из определенной стероидной области. Демонстрацию процедуры проведет А. Шарп, research assistant нашей лаборатории. Начните подготовку к формированию 3D-стероидов, нагрев в микроволновке 1,5% agarose в 100 миллилитрах сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) в течение трех-пяти минут, периодически перемешивая колбу для полного растворения agarose. Затем немедленно перенесите пипеткой 100 µL раствора agarose в каждую лунку плоской 96-луночной культуральной пластины. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение одного часа до полного затвердевания agarose.

Затем изьизвлеките из инкубатора культуру клеток меланомы, экспрессирующих конструкции FCI, при достижении 80% конфлюэнтности. Промойте клетки 10 миллилитрами HBSS. Добавьте 1,5 миллилитра 0,05% EDTA, после чего инкубируйте клетки при 37 °C в течение приблизительно двух минут.

После того как клетки открепятся, суспендируйте их в 10 мл среды для культивирования клеток. Вручную подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и перевернутого микроскопа, затем разведите их в среде для культивирования до концентрации 25 000 клеток на мл. Затем пипеткой перенесите 200 мкл клеточной суспензии, чтобы покрыть каждую лунку 96-луночного планшета.

Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение примерно трех дней для формирования сфероидов клеток. После инкубации снимите изображения сфероидов на инвертированном микроскопе, используя объектив Forex и фазово-контрастный фильтр. Сфероиды должны выглядеть как компактные, приблизительно сферические клеточные агрегаты; подготовьте клеточные сфероиды для секционирования и визуализации.

С помощью дозатора на 1 мл перенесите их в пробирку Falcon. Затем дайте сфероидам осесть на коническое дно пробирки. После этого удалите среду путем аспирации и зафиксируйте сфероиды, инкубируя их в 10% нейтральном фосфатно-буферизованном формалине в течение не менее двух часов при комнатной температуре.

Затем SP можно хранить в HBSS при температуре четырех градусов Цельсия в течение нескольких дней после секционирования и получения изображений клеток. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и выберите конфигурацию «только количественный анализ». Затем создайте новую библиотеку и импортируйте файл конфокального изображения сфероида, перетащив файл с необработанными данными в библиотеку.

Затем перейдите на вкладку измерений (measurements), чтобы создать протокол анализа изображений, перетаскивая команды в правильном порядке в окно протокола. Чтобы найти объекты в зеленом канале, перетащите команду «найти объекты» (find objects) из раздела поиска (finding) в окно протокола и выберите соответствующий канал. Добавьте команду «открыть» (open), которая находится в разделе обработки (processing), а затем добавьте отдельную команду «соприкасающиеся объекты» (touching objects), чтобы разделить клетки.

Наконец, в разделе фильтрации добавьте и исключите объекты по размеру. Установите команду для объектов размером менее 50 µm, чтобы исключить мелкие неклеточные объекты. Затем перетащите новую команду Find Objects в окно протокола.

Повторяя те же действия, выберите красный канал и выполните все последующие команды. После того как объекты будут найдены, используйте команды «скрыть канал» (hide channel) или «показать канал» (show channel), чтобы визуально убедиться, что красные и зеленые объекты соответствуют красным и зеленым ядрам. При необходимости перейдите в раздел «измерения» (measurements), а затем в «параметры обратной связи» (feedback options), чтобы изменить вид масок объектов.

Теперь для поиска желтых объектов, соответствующих клеткам в ранней S-фазе, используйте команду intersect (пересечение) в разделе combining (объединение) и выберите вариант intersect red objects with green objects (пересечение красных объектов с зелеными). Снова исключите объекты размером менее 50 µm. Чтобы идентифицировать клетки в G1-фазе, используйте команду subtract (вычитание) в разделе combining и выберите subtract yellow object from red objects (вычитание желтых объектов из красных), чтобы найти исключительно красные объекты.

Аналогичным образом, вычтите желтые объекты из зеленых, чтобы идентифицировать исключительно зеленые объекты, которые соответствуют SG two и клеткам фазы MPH, как для исключительно красных, так и для исключительно зеленых объектов. При необходимости удалите неклеточные объекты, применив команду фильтрации популяции из раздела фильтрации с коэффициентом формы (shape factor) более 0,25. Затем найдите контур S-сфероида.

Используйте команду «find objects» (поиск объектов) из раздела «finding» (поиск) в зеленом или красном канале. Используйте команду «closed» (закрытие) из раздела «processing» (обработка), чтобы объединить отдельные клетки в один объект. Затем добавьте команду «fill holes in objects» (заполнение отверстий в объектах), чтобы заполнить отверстия в сферах.

Затем используйте фильтр тонкой очистки, чтобы удалить шум из объекта Sphero. Завершите поиск контура сфероида, выбрав функцию исключения объектов по размеру, чтобы удалить объекты размером менее 30 000 micrometers. После того как все объекты будут определены, добавьте функцию измерения расстояний из соответствующего раздела, чтобы определить расстояние от каждого OID до края контура сфероида S.

Повторите эти действия для каждой из популяций: желтых, исключительно красных и исключительно зеленых. Чтобы визуализировать минимальные расстояния от клетки до ближайшего края S-сфероида, откройте вкладку «Measurements» (Измерения), выберите «Feedback options» (Параметры обратной связи), затем «Relationships» (Связи). После этого выберите «Show distances» (Показать расстояния).

Наконец, сохраните протокол, чтобы сохранить данные, полученные с его помощью. В разделе измерений выберите пункт «выполнить измерение» (make measurement). Затем для интерпретации данных выберите объект измерения, перейдите на вкладку «анализ» (analysis) в разделе измерений и выберите «анализировать» (Analyze) в меню анализа, чтобы подсчитать количество клеток, обнаруженных на определенном расстоянии от края стероида.

Создайте фильтр, выбрав пункт filter (фильтр) на вкладке analysis (анализ). Например, отобразите только те данные, где расстояние от края сферы составляет менее 100 microns. Чтобы экспортировать необработанные данные, выберите export (экспорт) на вкладке file (файл), а затем сохраните данные в виде текста с разделителями-запятыми или табуляцией.

Эти данные можно открыть в программе для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа. Сфероиды клеток, полученные из C 8 1 16 1. Клетки меланомы человека, трансдуцированные с помощью системы Fuji, были зафиксированы и разрезаны на срезы.

Была выполнена конфокальная визуализация с использованием AZA green, который маркирует клетки в фазе G2/M клеточного цикла, и Berra orange, который маркирует клетки в фазе G1. При наложении этих изображений, как и ожидалось, можно наблюдать такие ключевые особенности, как некротическое ядро. Клетки, задержанные в фазе G1 (красного цвета), преобладают ближе к этому некротическому ядру, в то время как количество пролиферирующих клеток красного и зеленого цвета увеличивается по градиенту к внешнему краю сфероида, где доступ к кислороду и питательным веществам максимален.

После полуавтоматического анализа изображений определяются маски клеток fucci и контур S-сфероида. С помощью программного обеспечения для визуализации было проведено количественное определение красных и зеленых клеток во внутренней или внешней области S-сфероида. Этот анализ показал, что клетки, арестированные в фазе G1, обогащены во внутренней области, в то время как пролиферирующие клетки преобладают ближе к краю сфероида.

После освоения эта методика может быть выполнена за одну-две недели; в этот период входит выращивание сфероида, визуализация и анализ. После завершения данной процедуры сфероиды могут быть имплантированы в коллагеновый матрикс с последующей визуализацией с помощью микроскопии в режиме таймлапс. Затем они могут быть подвергнуты анализу белков или РНК, что поможет ответить на такие вопросы, как влияние положения в сфероиде, а также доступа к кислороду и питательным веществам на фенотипы раковых клеток.