Imaging- и проточной цитометрии на основе анализа клеточной позиции и клеточного цикла в 3D меланомы сфероидов

Общей целью данного метода является идентификация, характеристика и выделение клеток из многоклеточного стероида в отношении статуса их клеточного цикла и положения в стероиде по сравнению с двумерной клеточной культурой. 3D-модель OID резюмирует биологию рака in vivo, поскольку она имитирует архитектуру опухоли и ее микроокружение, сопоставляя сферо с методами проточной цитометрии и визуализации. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области рака, например, как микроокружение опухоли изменяет чувствительность к лекарствам, подвижность клеток и пролиферацию.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет визуализировать клеточный цикл в режиме реального времени и позволяет очищать живые клетки из определенной стероидной области, демонстрируя то, как будет проводиться процедура. Шарп, научный сотрудник из нашей лаборатории, начинает подготовку к 3D-образованию стероидов, разогревая в микроволновой печи 1,5% арос в 100 миллилитрах балансового раствора соли Хэнка или HBSS или в течение трех-пяти минут с перерывами, чтобы обеспечить что AROS полностью растворен. Затем немедленно пипеткой ввели по 100 микролитров раствора ароса в каждую лунку 96-луночного планшета для культуры тканей с плоским дном. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение часа, чтобы они затвердели.

Затем удалите 80%-ную конфлюенсную клеточную культуру клеток меланомы, экспрессирующих конструкции FCI, из инкубатора для клеточных культур. Промойте клетки 10 миллилитрами HBSS. Добавьте 1,5 миллилитра 0,05% в ЭДТА, а затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно двух минут.

Как только клетки открепятся, суспензируйте их в 10 миллилитрах клеточной культуры. Терпимая. Вручную подсчитайте клетки с помощью гемо, цитометра и инвертированного микроскопа и разведите их до 25 000 клеток на миллилитр в среде для культивирования клеток. Затем пипеткой 200 микролитров клеточной суспензии наложить на каждую лунку 96-луночный арос-планшет.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение примерно трех дней, чтобы образовались клеточные сфероиды. Последующее инкубационное изображение сфероидов на инвертированном микроскопе с использованием объектива Форекс и фазово-контрастного фильтра. Сфероиды должны выглядеть как компактные, примерно сферические клеточные агрегаты для подготовки клеточного стероида к срезированию и визуализации.

С помощью пипетки объемом в один миллилитр переместите их в соколиную трубку. Затем дайте стероиду осесть на дне конуса. Затем удалите среднюю аспирацию, а затем зафиксируйте сфероиды, инкубируя их в 10% нейтральном буферизованном формине в течение не менее двух часов при комнатной температуре.

Затем SP может храниться в HBSS при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней после разрезания и визуализации клетки. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и выберите конфигурацию только для количественной оценки. Затем создайте новую библиотеку и импортируйте файл конфокального изображения сфероида, перетащив файл необработанных данных в библиотеку.

Затем перейдите на вкладку измерений, чтобы построить протокол анализа изображений, перетаскивая команды в правильном порядке в окне протокола. Чтобы найти объекты в зеленом канале, перетащите команду find objects из раздела поиска в окно протокола и выберите соответствующий канал. Добавьте команду «Открыть», находящуюся в процессе обработки, а затем добавьте отдельную команду «Касание объектов» для разделения ячеек.

Наконец, в разделе фильтрации добавьте и исключите объекты по размеру. Команда для объектов размером менее 50 мкм, чтобы исключить мелкие неячеистые объекты. Затем перетащите новую команду поиска объектов в окно протокола.

Выполнив те же действия, выберите красный канал и примените все последующие команды. После того как объекты будут найдены, используйте команды hide channel или show channel, чтобы визуально убедиться, что красные и зеленые объекты соответствуют красным и зеленым ядрам. При необходимости нажмите на измерения, а затем на параметры обратной связи, чтобы изменить внешний вид масок объекта.

Теперь, чтобы найти желтые объекты, соответствующие ранним ячейкам S-фазы, используйте команду пересечения, найденную в разделе объединения, и выберите пересечение красных объектов с зелеными объектами. Опять же, исключите объекты размером менее 50 микрометров. Чтобы определить однофазные ячейки G, используйте команду вычитания, найденную в разделе объединения, и выберите «Вычесть желтый объект из красных объектов», чтобы найти исключительно красные объекты.

Аналогичным образом, вычитание желтых объектов из зеленых объектов для идентификации исключительно зеленых объектов, которые коррелируют с SG 2 и фазовыми ячейками MPH как для исключительно красных, так и исключительно для зеленых объектов. При необходимости удалите объекты, не являющиеся ячейками, применив команду фильтра из раздела фильтрации с коэффициентом формы больше 0,25. Затем найдите контур сфероида S.

Использование команды поиска объектов из раздела поиска в зеленом или красном канале. Используйте закрытую команду из раздела обработки, чтобы объединить отдельные ячейки в один объект. Затем добавьте команду заполнения отверстий в объектах, чтобы заполнить отверстия в sphe.

Затем используйте тонкий фильтр для удаления шума с объекта Sphero. Завершите нахождение контура сфероида, выбрав опцию «Исключить объекты по размеру», чтобы удалить объекты размером менее 30 000 микрометров. После того, как все объекты определены, добавьте измерения расстояний от соответствующего сечения, чтобы определить расстояние от каждого OID до края контура сфероида S.

Делайте это в каждой из желтых, исключительно красных и исключительно зеленых популяций. Чтобы визуализировать минимальные расстояния от ячейки до ближайшего края сфероида S, откройте вкладку измерений и выберите опции обратной связи, а затем взаимосвязи. Затем выберите «Показать расстояния».

Наконец, сохраните протокол, чтобы сохранить данные, созданные протоколом. Выберите элемент измерения в разделе измерения. Затем, чтобы интерпретировать данные, выберите элемент измерения, перейдите на вкладку «Анализ» в разделе измерения и выберите «Анализ» в меню анализа, чтобы подсчитать клетки, обнаруженные на определенном расстоянии от края стероида.

Создайте фильтр, выбрав фильтр на вкладке анализа. Например, показывать только те данные, где расстояние от края сферы меньше 100 мкм. Чтобы экспортировать необработанные данные, выберите «Экспорт» на вкладке «Файл», а затем сохраните данные в виде текста, разделенного запятыми, или текста, ограниченного табуляцией.

Эти данные могут быть открыты в программе для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа. Клетка сгенерирована из C 8 1 16 1. Клетки меланомы человека, которые были трансдуцированы с помощью системы Фудзи, были зафиксированы и разрезаны.

Была проведена конфокальная визуализация для зеленого цвета AZA, который отмечает клетки в фазе SG two M клеточного цикла, и оранжевого цвета Берра, который отмечает клетки в фазе G one. Когда эти изображения накладываются друг на друга, ключевые особенности, такие как некротическое ядро, можно наблюдать как и ожидалось. Красные G, арестованные клетки, преобладают ближе к этому некротическому ядру, в то время как красные и зеленые пролиферирующие клетки увеличиваются градиентным образом к внешнему краю стероида, или доступ к кислороду и питательным веществам максимален.

После полуавтоматического анализа изображений можно определить маски клеток Фуччи и контур S-сфероида. Программное обеспечение для визуализации использовалось для количественного определения красных и зеленых клеток во внутренней или внешней области S-сфероида. Этот анализ показал, что G однофазные арестованные клетки обогащаются во внутренней области, в то время как пролиферирующие клетки преобладают ближе к стероидному Edge.

После освоения эта техника может быть выполнена за одну-две недели, время, которое включает в себя выращивание стероида, визуализацию и анализ. После этой процедуры рады могут быть имплантированы в коллагеновый матрикс, а затем визуализированы с помощью микроскопии TimeLapse. Затем они могут быть подвергнуты анализу белка или РНК, и это может помочь нам ответить на такие вопросы, как может ли положение в стероиде и доступ к кислороду и питательным веществам изменить фенотипы раковых клеток.