Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Общая цель этого метода заключается в управлении потенциалом клеточной мембраны при стимуляции импульсами видимого света. Процесс фототрансдукции опосредован светочувствительным сопряженным полимером. Этот метод представляет собой новый инструмент в области технологий, поскольку он представляет собой ценную альтернативу существующим методам, таким как оптогенетика и тепловая стимуляция, для оптического контроля активности живых клеток.

Основными преимуществами данной методики являются быстрая интегрируемость с любым типом электрофизиолога, потенциально высокое специальное и временное разрешение, снижение травматичности. Более того, это позволяет избежать переноса генов, который требуется оптогенетике. Здесь описан наш метод фотостимуляции культуры клеток in vitro.

Но это может открыть и интересные возможности для применения in vivo. Демонстрировать процедуру будут Катерина Боссио и Сюзана Вакеро Мората постдоки из наших лабораторий с образованием в области биологической и физической химии соответственно. Для начала приготовьте раствор светочувствительного сопряженного полимера путем смешивания P3HT и PCBM в хлорбензине в относительной концентрации один к одному.

Перемешивайте раствор магнитной мешалкой не менее четырех часов при температуре 60 градусов Цельсия. Затем очистите стеклянные предметные стекла, покрытые оксидом индия и олова, с последовательными 10-минутными ваннами с деионизированной водой, ацетоном и изопропанолом в ультразвуковом аппарате. Просушите покровные стекла азотным пистолетом, а затем обработайте основания плазменным очистителем.

После очистки установите затвор на патрон прядильной машины стороной с покрытием ITO вверх. Далее добавьте 150 микролитров раствора P3HT PCBM на предметное стекло и покройте образец. После того, как спиньера будет готова, удалите образец и используйте тампон для чистой комнаты, смоченный в ацетоне, чтобы очистить обратную сторону подложки.

Простерилизуйте фотоактивные подложки, поместив их в закрытый термостойкий контейнер и нагревая при температуре 120 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем перенесите образцы в стерильный колпак и дайте им остыть. С этого момента поддерживайте стерильность образцов.

Поместите фотоактивные субстраты в шестилуночную пластину. Учитывая гидрофобность сопряженного полимерного слоя, сделайте полидиметилсилоксановую лунку для фиксации образца и ограничьте растворы, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем поместите фотоактивные субстраты в лунки планшета и покройте всю поверхность каждого образца 500-750 микролитрами двух миллиграммов на литр раствора фибронектина в PBS.

Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее одного часа. После инкубации используйте стеклянную пипетку, чтобы удалить раствор фибронектина, а затем промойте субстраты один раз двумя миллилитрами PBS. Во-первых, добавьте общий объем от 750 до 1 000 микролитров полной питательной среды на лунку.

Затем поместите 15 000 клеток AGK293 на квадратный сантиметр фотоактивного субстрата в каждую лунку. Затем инкубируйте клетки в течение 24-48 часов. Клетки могут быть легко культивированы на фотоактивных субстратах при условии нанесения подходящего адгезионного слоя, такого как фибронектин.

Для начала приготовьте как внеклеточные, так и внутриклеточные растворы, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Стерилизуйте растворы, пропустив их через фильтр 0,2 мкм. Затем подогрейте внеклеточный раствор, поместив его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия.

Кроме того, наполните внутриклеточный раствор одномиллилилитровый шприц и вооружите его иглой 34-го калибра. Держите внутриклеточный раствор в контакте со льдом, чтобы избежать деградации АТФ. Далее возьмите из инкубатора субстрат, покрытый клеточным покрытием, и аккуратно хорошо удалите PDMS.

Затем удалите питательную среду стеклянной пипеткой и медленно промойте образец внеклеточным раствором, чтобы избежать отслоения клеток. Добавьте по три миллилитра внеклеточного раствора в каждую лунку, а затем перенесите планшет в держатель образца электрофизиологической станции. Установив электрод сравнения на место, установите его в лунку, которую необходимо проверить.

Далее приготовьте свежую стеклянную микропипетку для патч-зажима с помощью съемника микропипетки. Заполните половину пипетки внутриклеточным раствором. С помощью микроманипулятора расположите патч-пипетку в непосредственной близости от выбранной клеточной мембраны.

Во время позиционирования надавите на пипетку, чтобы избежать налипания грязи на наконечник. Когда пипетка находится на высоте нескольких микрон над клеткой, начните опускать пипетку к клеточной мембране, одновременно измеряя сопротивление пипетки в программном обеспечении для управления патчами. Когда сопротивление пипетки увеличится примерно на один мегаом, устраните избыточное давление и примените мягкое всасывание, чтобы сформировать гигауплотнение между пипеткой и клеточной мембраной.

Затем подайте на пипетку отрицательный потенциал в 40 милливольт, чтобы стабилизировать уплотнение. Компенсируйте переходную емкость емкости пипетки с помощью относительных команд на патч-усилителе и/или программном обеспечении для управления патчами. Подайте короткий и интенсивный импульс всасывания в пипетку, чтобы разорвать мембрану и обеспечить электрический доступ к цитоплазме клетки.

Затем установите усилитель коммутации в режим токовых зажимов, чтобы ток не подавался в ячейку. В текущем режиме зажима отслеживайте потенциал клеточной мембраны и подождите несколько минут, пока он стабилизируется. После стабилизации примените желаемый протокол освещения к клетке, освещая фотоактивную мембрану под клеткой светом в диапазоне от 450 до 600 нанометров.

Запишите влияние света на мембранный потенциал. Короткие световые импульсы продолжительностью от 10 до 20 миллисекунд приводят к временной деполяризации клетки, в то время как при длительном освещении в течение сотен миллисекунд наблюдается гиперболизация до тех пор, пока свет не выключается. Оптическая стимуляция клеток, опосредованная фотоактивными субстратами, может приводить к различным воздействиям на клеточную мембрану, в зависимости от продолжительности светового стимула.

За быстрым скачком, подобным показанному здесь, следует временная деполяризация порядка десятков миллисекунд. Для коротких импульсов света при выключении света наблюдается противоположное поведение. Эти сигналы объясняются изменением емкости мембраны из-за локального нагрева после поглощения света.

При длительном освещении первоначальная деполяризация переходит в гиперполяризацию клетки. Это явление также имеет тепловое происхождение, но в данном случае оно связано с изменением равновесного потенциала мембраны из-за изменения проводимости ионного канала, вызванного повышением температуры. Важно отметить, что этот метод является довольно гибким и может быть адаптирован к конкретным потребностям конкретного эксперимента, например, путем изменения фотоксического полимера, процесса изготовления или протокола освещения.

Однако, прежде чем менять протокол, следует сначала проверить важные свойства активного полимера, такие как его биосовместимость, пригодность к процессу стерилизации, электрохимическая и временная стабильность. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как реализовать гибридный интерфейс между соединительными полимерами и живыми клетками и как использовать его для оптического контроля активности клеток. Мы считаем, что этот метод также обещает стать дополнительным инструментом в нейробиологии для исследований in vitro, а также открыть новые перспективы применения in vivo.

Однако для уточнения протокола необходимы энергичные и совместные усилия материаловедов и нейробиологов, физиков и врачей.