Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия

Общая цель этого эксперимента заключается в наблюдении за передачей колебательной информации от клетки к клетке посредством оптогенетического контроля и мониторинга экспрессии генов в реальном времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как клетки взаимодействуют друг с другом через сигнальный путь Notch, в частности, о том, как клетки передают осцилляторную информацию друг другу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем контролировать и отслеживать динамику экспрессии генов с очень высокой точностью.

Демонстрировать процедуру будет Акихиро Исомура, научный сотрудник из моей лаборатории, разработавший эту новую технологию. Для трансфекции плазмидных векторов оптогенетических модулей на основе Tol2 вместе с вектором экспрессии транспозазы в клетки C2C12 сначала подсчитывают трипсинизированные клетки с помощью клеточного счетчика. Планшет 50 000 клеток C2C12 на лунку в 12-луночном планшете за сутки до трансфекции.

Затем совместно трансфектировали 0,375 мкг оптогенетических векторов на основе Tol2, 0,125 мкг вектора выбора лекарственного средства и 0,5 мкг вектора экспрессии транспозазы с использованием реагента липофектиона. Трипсинизируйте трансфицированные клетки и поместите их в 100-миллиметровые чашки для культур через день после трансфекции. Замените питательную среду для трансфицированных клеток на питательную среду с добавлением 100 мг на миллилитр гигромицина.

Культивируйте клетки в течение трех дней, чтобы удалить нетрансфицированные клетки. Обратите внимание, что смена среды не требуется. Затем трипсинизируйте трансфицированные клетки и очистите популяцию клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки для отбора, отсортировав клетки-реципиент и фоточувствительные клетки, как подробно описано в текстовом протоколе.

Установите два типа инкубаторов с источниками света или без них: для световых и темных условий. Используйте экспонометр для настройки интенсивности света синего светодиодного трансиллюминатора. Измерьте интенсивность света после закрытия дверцы.

Программирование таймингов и продолжительности светового освещения путем загрузки скрипта управления на одноплатный микроконтроллер, который позволяет программировать графики освещения. Подсчитайте трипсинизированные клетки с помощью счетчика клеток и наберите 100 000 фоточувствительных клеток-отправителей, несущих pAI218 и pAI170 на пластиковых чашках для культур диаметром 35 миллиметров. Установите посуду в отдельные инкубаторы для темных и светлых условий.

После установки посуды держите дверцы инкубаторов закрытыми до сбора клеточных лизатов. Через полтора дня после обшивки приступают к световой подсветке. Не подвергайте клетки воздействию неконтролируемого света, чтобы избежать нежелательной фотостимуляции.

Итак, проделайте этот шаг, не открывая дверцу. Обратите внимание, что открывать дверцу здесь можно только для демонстрации. Примерно через два дня после нанесения покрытия переместите чашки с образцами из инкубаторов в лед с 30-минутными интервалами и начните подготовку клеточных лизатов для дальнейшего анализа.

Для мониторинга клеточных реакций на оптическую стимуляцию с помощью ФЭУ в режиме реального времени сначала трипсинизируют и подсчитывают количество клеток-отправителей и приемников с помощью стандартных методов. Приготовьте суспензию общего объема объемом в один миллилитр из 25 000 приемных и 125 000 передающих ячеек. В каждой лунке из 24-луночных черных планшетов насыпьте смешанные клетки питательной средой, содержащей один миллимолярный люциферин.

Проанализируйте ячейки на планшетном ридере для анализа люциферазы, чтобы убедиться, что выходные сигналы не слишком высоки для записывающей системы. Далее установите пластину на записывающую систему и запустите программу записи. Например, включите световую подсветку через 18 часов после настройки записи.

Для визуализации реакций одиночных клеток в режиме реального времени под контролем оптогенетического возмущения, первая пластина 50 000 принимающих и 250 000 передающих клеток помещаются на стеклянное основание диаметром 27 мм и диаметром 35 мм. Убедитесь, что пропорции смешивания и общее количество ячеек правильно отрегулированы. Через сутки после нанесения покрытия замените носитель на два миллилитра записывающего носителя.

Установите чашку со стеклянным основанием на инвертированный микроскоп, оснащенный климатической камерой при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Настройте охлаждаемую ПЗС-камеру. Убедитесь, что температура ПЗС-сенсора охлаждена до целевого значения.

Задайте параметры многомерного окна покадровой съемки в программном обеспечении автоматического сбора данных для захвата изображений с пятиминутными интервалами и более 288 раз. В окне многомерной интервальной съемки выберите канал люминесценции. Убедитесь, что режим считывания установлен на медленный режим считывания 50 килогерц, что имеет решающее значение для уменьшения шумов считывания при обнаружении слабо излучающего биолюминесцентного света.

В окне многомерной интервальной съемки выберите флуоресцентные каналы. Убедитесь, что режим считывания установлен на режим быстрой печати в один мегагерц, чтобы сократить время, необходимое для флуоресцентной визуализации. Наконец, установите группирование два на два с экспозицией 400 миллисекунд.

Затем выберите вкладку журнала, чтобы настроить расписания для стимуляции клеток периодическим освещением синим светом. Нажмите кнопку с плюсом, чтобы добавить новую настройку журнала. Выберите файл журнала в окне журнала, выберите несколько временных точек и задайте значения в полях начальных точек и интервалов, чтобы запланировать стимуляцию.

Убедитесь, что указанный файл журнала содержит последовательные протоколы для выбора освещения, открытия затвора, задержки, закрытия затвора и задержки. Затем установите графики для стимуляции клеток с помощью периодического освещения синим светом. Наконец, запустите покадровую запись, нажав кнопку «Получить».

Наконец, извлеките одноклеточные следы люминесцентных каналов из покадровых фильмов, как описано в текстовом протоколе. Представлены репрезентативные результаты оптогенетических анализов отправителя-приемника. Фотоиндуцируемые клетки-отправители продуцировали колебательные паттерны экспрессии дельта-лиганда в присутствии периодического освещения синим светом, как и ожидалось.

Когда клетки-реципиенты культивируются совместно со светочувствительными клетками-отправителями и подвергаются воздействию повторяющегося светового освещения, система биолюминесцентной регистрации в режиме реального времени обнаруживает циклические реакции клеток-реципиентов в различных условиях соотношений смешивания. Кроме того, покадровая микроскопия с повторяющимся световым освещением также выявляет синхронизированные ответы клеток-приемников на уровне отдельных клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению того, как динамическая информация об экспрессии генов передается при межклеточных взаимодействиях.