Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Общая цель этой процедуры заключается в оптическом контроле функции нейронного белка с помощью генетически кодируемой, неестественной аминокислоты в нейронах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о вкладе конкретного нейронного белка в передачу сигналов нейронов в функции мозга с пространственным временным разрешением. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть применена к различным нейронным белкам для достижения оптической регуляции различных нейронных процессов.

Начните эту процедуру с нанесения нейронов гиппокампа на покровные листы в 24-луночном планшете с 500 микролитрами питательной среды после фильтрации через нейлоновую сетку толщиной 40 микрометров. После этого инкубируйте культуру нейронов при температуре 35 градусов Цельсия в инкубаторе, содержащем 5 процентов углекислого газа и 95 процентов увлажненного воздухом, в течение 2-3 недель. В день трансфекции внесите свежий 2,5 молярный раствор хлорида кальция в дважды дистиллированную воду, и стерильно отфильтруйте его фильтром 0,22 мкм.

Затем приготовьте свежий 2X BBS при pH 7 и стерильно отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 микрометра. После этого замените питательную среду на 500 микролитров свежей, предварительно подогретой трансфекционной среды, и не выбрасывайте старую питательную среду. Раствор для трансфекции готовят непосредственно перед добавлением его в культуру, соединяя хлорид кальция и дважды дистиллированную воду, медленно перемешивая пробирку.

Продолжайте помешивать пробирку и медленно добавляйте в раствор ДНК. Затем добавьте 2X BBS буфер по каплям. Приготовление 2X BBS буфера является критическим этапом в трансфекции фосфата кальция, и хорошей идеей является калибровка оптимального pH для 2X BBS буфера в диапазоне от 6,90 до 7,15 для новых конструкций или препов ДНК.

Затем немедленно добавьте 30 микролитров раствора для трансфекции в каждый покровный листок культуры нейронов. Покачайте чашку для культуры несколько раз, чтобы перемешать раствор, и инкубируйте его при температуре 35 градусов Цельсия в течение от 45 минут до одного часа. Примерно через час должен наблюдаться слой мелкодисперсных осадков фосфата кальция, покрывающий нейроны.

Затем замените передающую среду 500 микролитрами предварительно подогретого буфера для стирки и инкубируйте его при температуре 35 градусов Цельсия в течение 15-20 минут. Осадки фосфата кальция должны исчезнуть после стирки. Теперь замените промывочный буфер на 500 микролитров свежей питательной среды.

После этого замените питательную среду сохраненной исходной средой. Затем добавьте в культуру предварительно смешанную ненатуральную аминокислоту Cmn в 50 микролитрах теплой питательной среды, что приведет к конечной концентрации в один миллимоляр. Инкубируйте трансфицированную культуру при температуре 35 градусов Цельсия в течение 12–48 часов до записи.

В этой процедуре готовят экстра- и внутриклеточные растворы. В нашей установке светодиод с излучением 385 нанометров установлен рядом с микроскопом и подает свет на расстоянии одного сантиметра от фокальной точки под углом 45 градусов. Затем вытяните несколько патч-пипеток стеклянным электродом с помощью микропипетки.

После этого возьмите покровную салфетку для культуры нейронов из инкубатора и промойте ее один раз во внеклеточном растворе. Пропитайте установку внеклеточным раствором. Затем поместите покровное стекло на платформу электрофизиологического микроскопа, используя стандартные методы зажима пластыря.

Заплатите нейрон, трансфицированный флуоресцентными М-цитринами. Далее запишите активность нейронов с помощью метода текущего зажима. Во-первых, отрегулируйте потенциал покоя примерно на отрицательные 72 милливольта.

Затем введите ступенчатый ток, чтобы вызвать непрерывное возбуждение потенциалов действия с частотой от пяти до 15 Гц. Во время записи подавайте одиночные светодиодные импульсы к нейрону и следите за изменениями его потенциалов действия. Затем добавьте в ванну 0,5 миллимоляра хлорида бария, чтобы восстановить потенциалы действия.

В условиях острого среза мозга запатчируйте нейрон флуоресцентными M-вишнями GFP из неокортикальной области. Затем запишите активность PIRK с помощью метода линейного напряжения. В частности, контролируйте удельные внутренние токи Kir2.1 при отрицательных 100 милливольтах.

Затем подайте одиночные светодиодные импульсы на нейрон во время записи и отслеживайте, активируются ли белки PIRK. Как только PIRK будет активирован, внутренние токи при отрицательных 100 милливольтах значительно возрастут. В конце добавьте в ванну 0,5 миллимоляра хлорида бария и проверьте, не инактивирован ли PIRK.

Здесь представлены примеры изображений культур нейронов гиппокампа здоровых крыс. И два здоровых нейрона с пухлыми клеточными телами и ярко выраженными дендритами и аксонами. Это ДВС-и флуоресцентные изображения культур нейронов гиппокампа крысы in vitro и трансфицированных для экспрессии PIRK без CMN.

В присутствии одного миллимолярного CMN трансфицированные нейроны способны экспрессировать полноразмерные белки PIRK M-цитрин, тем самым демонстрируя зеленую флуоресценцию. А вот пример одиночного светового импульса, подавляющего активность выраженного PIRK гиппокампального нейрона. Эти изображения флуоресценции эмбриональных корковых нейронов мышей показывают успешное включение CMN в белки GFP и Kir2.1 in vivo.

На этом графике светозависимая активация PIRK указана в токах, регистрируемых нейронами неокортикального мозга мыши. Применение этой методики распространяется на терапию заболеваний головного мозга, вызванных сбоем в работе специфических нейронных белков, например, мутировавшего Kir2.1 при синдроме Андерсена, потому что этот метод помогает выявить, на какие мозговые схемы влияет дефицит Kir2.1. После освоения эта техника может быть использована для управления функцией нейронных белков с высокой специфичностью света в живых нейронах.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как встраивать неестественные аминокислоты в белки нейронов для достижения фотоконтроля над интересующими вас нейронными белками.