Крупномасштабное Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Nanotomy) здоровых и оскорбленные данио мозга

Общая цель этой крупномасштабной электронной микроскопии или эксперимента по нанотомии состоит в том, чтобы определить изменения от макромолекулярного уровня к тканевому уровню, в сегодняшнем случае, в дегенеративном мозге рыбок данио. Нанотомия может помочь ответить на ключевые вопросы в области наук о жизни. Например, в нейродегенерации и в исследованиях диабета 1 типа.

Главное преимущество нанотомии заключается в том, что получается непредвзятая информация, начиная от макромолекул, органелл, клеток и заканчивая тканями. Это позволяет проводить количественную оценку и обмениваться данными в открытом доступе через nanotomy.org. Хотя нанотомия дает представление о поддержании иммунитета и микроглии в нейродегенеративном мозге рыбок данио, она также применяется к другим моделям заболеваний, включая клеточную культуру, мышь и даже человеческие ткани.

Как правило, ученые, не знакомые с этой техникой, испытывают трудности, потому что количество данных ошеломляет. Это может быть в тысячу раз больше, чем получается при использовании традиционных ЭМ. После фиксации личинок данио рерио согласно текстовому протоколу, разрежьте головки личинок рострально к заднему мозгу, чтобы облегчить проникновение осмия. Поместите личинки в 1%-ный тетраоксид осмия, 1,5%-ный ферроцианид калия, в 0,1 молярного какодилата натрия и инкубируйте на льду в течение двух часов.

Затем используйте двойную дистиллированную воду, чтобы промыть эмбрионы три раза в течение пяти минут каждый раз. Перед заделкой образцы необходимо обезвожить в серии этанола. Чтобы внедрить эмбрионы, после инкубации в разведенной эпоксидной смоле в течение ночи в соответствии с текстовым протоколом, удалите разведенную смолу и используйте чистую смолу для ее замены.

Инкубируйте в течение 30 минут, затем замените смолу во второй раз и выдерживайте еще 30 минут. Освежив смолу в третий раз, выдерживать при комнатной температуре в течение трех часов. Затем инкубируйте при температуре 58 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Наконец, инкубируйте при низком давлении при комнатной температуре в течение одного часа. Затем под микроскопом для препарирования с помощью иглы или зубочистки сориентируйте головки в имеющихся в продаже силиконовых плоских формах для встраивания. Затем полимеризуйте эпоксидную смолу при температуре 58 градусов Цельсия в течение ночи.

Когда образец полностью затвердеет, используйте бритвенные лезвия, чтобы удалить излишки смолы с огрызка. Чтобы определить правильное положение, используйте стеклянный нож или алмазный гистонож на ультрамикротоме, чтобы вырезать полутонкие срезы личинок толуидинового синего/основного фуксина. Перенесите полутонкие срезы на микроскопические предметные стекла, захватив их стеклянной пастеровской пипеткой, кончик которой был закрыт путем расплавления в пламени.

Сушите на горячей плите, пока не останется воды. Затем поместите образцы в 1%-ный толуидиновый синий цвет в воду и инкубируйте срезы на горячей плите в течение 10 секунд, чтобы окрасить их. Затем, после использования воды для промывки срезов, используйте 05% основного фуксина в 1% тетраборате натрия, чтобы окрашивать образцы еще на 10 секунд.

С помощью обычного светового микроскопа с температурой от 10X до 40X исследуйте образцы. Когда достигнут правильный участок или ориентация, используйте легко идентифицируемые анатомические структуры, включая обонятельные ямки, глаза или границы серого и белого вещества, чтобы определить интересующую область мозга во время ультратонкого среза и отрегулировать угол среза при наклоне образца. Продолжайте резать блок эпоксидной смолы алмазным ножом, чтобы вырезать ультратонкие участки размером 70 нанометров.

Установите каждую секцию на один слот L2 на 1 с медной сеткой со штрих-кодом, чтобы обеспечить непрерывный сбор данных с помощью стержней сетки. Квадратный миллиметр может показаться маленьким. Он как раз поместится в проем.

Таким образом, мы предотвращаем блокировку нашего образца полосами сетки. Поймите, что каждый артефакт, представленный в нашем образце, будет записан в сравнении с традиционной EM. Сравните образцы с тяжелыми металлами в соответствии с текстовым протоколом и храните в сетчатой коробке. Чтобы установить образец в сканирующий электронный микроскоп, или СЭМ, поместите сетку из передаточной коробки с секцией в держатель образца с множественной сеткой и перенесите ее в камеру СЭМ.

После выравнивания детектора в соответствии с текстовым протоколом предварительно облучите образец, уменьшив масштаб, чтобы вся сканируемая область поместилась в окне изображения. После того как апертура будет изменена на 120 микрометров и изображение будет расфокусировано, используйте опцию сканирования уменьшенной площади, чтобы сделать сканируемую область как можно более плотной. Затем установите частоту кадров для сканирования кадра примерно за одну-две секунды.

Затем увеличьте масштаб не менее чем в 100 раз и сканируйте небольшую область в течение 10 секунд. Если яркость в области все еще изменяется, продолжайте предварительное облучение. Когда эта область не изменяет яркость по сравнению с окружающей средой, достаточно предварительного облучения.

Находясь в фокусе, выберите самую светлую область или объект и установите скорость сканирования так, чтобы были видны детали. В программном обеспечении микроскопа отрегулируйте яркость и контрастность, внимательно наблюдая за гистограммой, чтобы все пиксели оставались в динамическом диапазоне. Проделайте то же самое для самых темных областей и объектов.

Вернитесь к светлой области и проверьте еще раз, чтобы по обе стороны гистограммы было немного места. Для шагов с четвертого шестого по четвертый восьмой регулировка яркости и контрастности должна производиться очень тщательно, чтобы вся область находилась в динамическом диапазоне. Уменьшите масштаб так, чтобы вся сканируемая область поместилась в окне визуализации, и запустите программу сбора больших площадей.

Затем используйте опцию мастера, чтобы настроить мозаику, выбрав область на экране. Используйте размер пикселя от двух до пяти нанометров, в зависимости от того, какие детали необходимы, и установите время задержки в три микросекунды для сканирующей просвечивающей электронной микроскопии, или STEM. Нажмите «Оптимизировать», чтобы проверить настройки микроскопа, и отобразится необходимое время.

Затем снова включите внешний сканирующий генератор и нажмите «Продолжить». Чтобы проанализировать данные STEM, откройте крупномасштабную программу просмотра EM-файлов и откройте файл под названием mosaic info, который откроет мозаичные файлы tif. Выберите опцию Автосшивание всей мозаики и выберите следующие параметры: режим перекрытия равен половине, порог сшивания равен 0.90, а шумоподавление равно автоматическому.

Если критерии сшивки не могут быть выполнены, увеличьте масштаб и вручную установите плитку на место, а затем нажмите кнопку «Продолжить как есть».Экспортируйте данные в виде файла HTML или одного файла. Укажите окончательный размер пикселя и имя файла, чтобы обеспечить измерения позже, а затем проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. Как показано здесь, нанотомия контрольных участков мозга выявляет типичные ультраструктурные особенности нервной ткани рострального переднего мозга, включая пучки обонятельных волокон, ядра нейронов и нейрональные субкомпартменты, включая синапсы.

Здесь субклеточные структуры включают в себя различные ядерные морфологии и очаги в различных типах клеток и органелл, включая аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, синаптические везикулы и постсинаптические плотности. Неожиданно оказалось, что ядра клеток, выстилающих желудочек, очень плотны в электронах по сравнению с другими клетками, более рассредоточенными в мозге латерально. При микроглии в ядрах также видны темные очаги, возможно, гетерохроматин, которые отсутствуют в других клетках мозга.

На этом изображении, полученном с помощью крупномасштабной ЭМ коронального разреза у личинки данио-рерио, подвергающейся нейрональной абляции, видна фагоцитарная микроглия. В этих клетках также были обнаружены особенности, характерные для микроглии в клетках млекопитающих, в том числе выдающийся аппарат Гольджи и многочисленные включения, такие как лизосомы. После освоения приобретение может быть выполнено в течение одного дня, тогда как традиционное ЭМ обойдется вам как минимум в неделю.

При попытке выполнить эту процедуру важно, чтобы оператор микроскопа играл решающую роль в получении высококачественных изображений. Это не просто техника нажатия кнопки. Теперь мы применили нанотомию не только к модели нейронной дегенерации у рыбок данио, но и для иммуномаркировки клеток и изучения тканей мух, тканей человека и многого другого.

Эта методика открывает путь для любых исследователей в любой области. Они могут вернуться к наборам данных в режиме онлайн на nanotomy.org. Затем они могут исследовать предполагаемые изменения, начиная от нанометрового и заканчивая миллиметровым масштабом, и все изучаемые модели.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как применять нанотомию к вашему исследовательскому вопросу и клеточной или тканевой системе, которую вы исследуете. Не забывайте, что из-за токсичных реагентов и этических соображений подготовкой образцов должен заниматься только профессионал, но попробовать сайт нанотомии может каждый. org у себя дома.