Прямая тока Стимуляция и Многоэлектродные массив Запись припадков, как активность мозга у мышей Кусочек Подготовка

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в изучении расположения электродов в регистрирующей камере при стимуляции постоянным током среза головного мозга и её влияния на эпилептиформную активность, регистрируемую с помощью многоэлектродной матрицы. Это поможет дать ответы на ключевые вопросы о стимуляции постоянным током и эпилептиформной активности в срезе мозга мыши, зафиксированной многоэлектродной матрицей. Преимуществом данного метода является возможность оценки эффектов стимуляции постоянным током в конкретных путях среза головного мозга мыши.

Процедуру продемонстрируют Хсян Чин и Вэй-Джен Чан, техники моей лаборатории. Перед началом эксперимента простерилизуйте все хирургические инструменты 75% раствором этанола. Затем обнажите череп животного и удалите остатки мышечной ткани.

Затем с помощью кусачек-ронжеров удалите дорсальную поверхность черепа и обрежьте боковые части. После этого, используя шпатель, перережьте обонятельные луковицы и нервные связи вдоль вентральной поверхности мозга, после чего извлеките его. Быстро перенесите мозг в стакан с ледяным оксигенированным ACSF.

Для подготовки срезов, содержащих путь MT-ACC, выполните сагиттальный разрез на 2 mm латеральнее срединной линии в каждом полушарии, чтобы обнажить субкортикальную анатомию. Затем сделайте наклонный поперечный разрез параллельно видимому волокну в стриатуме. Выполните второй наклонный поперечный разрез от места соединения мозжечка и зрительной коры до средней точки между передней комиссурой и зрительным трактом, которые расположены вентрально и параллельно поясному пути таламуса.

После этого прикрепите блок мозга к угловой пластине с помощью цианоакрилатного клея. Сделайте разрез чуть выше точки изгиба пути. Затем разверните пластину, выровняйте ее и приклейте к предметному столику камеры вибратома.

Затем нарежьте срезы мозга толщиной 500 micrometers и храните их в ледяном оксигенированном ACSF. Перенесите срез в регистрирующую камеру при температуре 32 degrees Celsius с непрерывной перфузией оксигенированного ACSF в течение одного часа. Подтвердите установку MEA-зонда в многоканальную систему.

Используйте одну трубку для подачи ACSF в камеру MEA, а другую — для отвода ACSF из камеры. Обеспечьте непрерывную перфузию препарата теплым насыщенным кислородом ACSF при 30 °C. С помощью влажного ватного тампона перенесите срез мозга на MEA.

Осторожно переместите срез мозга так, чтобы ACC находилась над электродами, затем зафиксируйте срез с помощью зажима для срезов, чтобы обеспечить хорошее электрическое соединение между срезом и электродами. После этого расположите анодный электрод проксимально по отношению к ACC, а катодный электрод — дистально по отношению к ACC. Запишите напряженность поля для двух ориентаций поля MEA.

Затем подайте электрический ток с помощью стимулятора. Установите расстояние между двумя хлорсеребряными электродами примерно в 1,5–2 cm и отрегулируйте силу тока стимулятора так, чтобы DCS составляла от 0,5 до 2 milliamps. В данной процедуре поместите вольфрамовый электрод в MT и подавайте импульсы от стимулятора в таламогенную область среза.

Далее используйте различные значения силы тока, чтобы определить порог, вызывающий ответ ACC. Перемещайте вольфрамовый электрод вдоль таламоцингулярного пути для получения оптимального профиля ответа. Зарегистрируйте 1–20 ответов ACC и используйте программное обеспечение для автоматического усреднения всех ответов ACC, вызванных стимуляцией MT.

Для индукции судорогоподобной активности добавьте 250 micromolar 48P и 5 micromolar бикукуллина в перфузионный раствор и продолжайте перфузию среза в течение двух-трех часов. Поддерживайте относительно высокую скорость работы насоса, что поможет предотвратить возникновение градиента pH. Затем установите вольфрамовый электрод в область MT и подайте электрическую стимуляцию для получения профиля ответа ACC.

Запишите 10-20 разверток и вычислите среднее значение ответов. После этого замените раствор для префузии свежим ACSF, чтобы вымыть препараты. В ходе данной процедуры обеспечьте создание однородных электрических полей, пропуская ток между двумя параллельными серебряными проводами с хлорид-серебряным покрытием, помещенными в камеру MEA.

При отсутствии проблем ток DCS должен оставаться в диапазоне от 0,5 до 2 мА. Затем выключите DCS и стимулируйте таламус вольфрамовым электродом. Для получения максимальных синаптических ответов в ACC зарегистрируйте 10–20 ответов, а затем рассчитайте их среднее значение.

Затем включите DCS и одновременно стимулируйте таламус. Оцените изменения амплитуды вызванного стимуляцией таламуса ответа ACC во время действия DCS. Теперь выключите DCS, добавьте в перфузионный раствор 250 micromolar 48P и 5 micromolar бикукуллина и подождите 2–3 часа.

Если препараты воздействуют на срез мозга, в срезе должны возникнуть кортикальные судорожные ответы. Затем зарегистрируйте 10-20 ответов передней поясной коры и измерьте амплитуду и продолжительность электрически вызванных кортикальных судорожных ответов. Далее включите DCS и одновременно стимулируйте таламус.

Оцените изменения амплитуды и продолжительности вызванных ответов при кортикальных судорогах во время применения DCS. После этого замените перфузионный раствор на свежий ACSF для вымывания препаратов. На данном рисунке представлены различные вызванные ответы, включая ответы в ACC, вызванные стимуляцией таламуса, судорожную активность, индуцированную препаратом, а также судорожную активность, вызванную как стимуляцией таламуса, так и действием препарата.

На этом рисунке показано влияние различных ориентаций при применении DCS, таких как разные направления электрического поля, ответы, вызванные стимуляцией таламуса при DCS, а также эффект катодной DCS на судорожную активность. На данном рисунке показано, что 15 минут катодной DCS эффективно индуцируют долгосрочную депрессию и подавляют вызванные ответы. Продолжительность судорог значительно сократилась после 15 минут катодной DCS по сравнению с отсутствием применения DCS.

быстрее; технически это можно сделать за четыре часа при правильном выполнении. После данной процедуры можно провести другие манипуляции, такие как транскраниальная магнитная стимуляция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о применении неинвазивных подходов для контроля резистентных судорожных приступов. После этой разработки данный метод открыл исследователям в области неинвазивной терапии путь к изучению способов лечения судорог на животных моделях.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать стимуляцию током для оценки судорожной активности в срезах мозга.