Прямая тока Стимуляция и Многоэлектродные массив Запись припадков, как активность мозга у мышей Кусочек Подготовка

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы получить доступ к расположению электродов в регистрирующей камере для стимуляции постоянным током среза мозга и его влиянию на судорожную активность, зарегистрированную с помощью многоэлектродной матрицы. Это может помочь ответить на ключевые вопросы в стимуляции постоянным током, а многоэлектродная матрица регистрирует судорожную активность в срезе мозга мыши. Преимущество этого метода заключается в том, что эффекты стимуляции постоянным током могут быть оценены в определенном пути среза мозга мыши.

Демонстрировать процедуру будут Сян Чин и Вэй-Жэнь Чанг, техники из моей лаборатории. В ходе этой процедуры перед экспериментом все хирургические инструменты стерилизуются 75% раствором этанола. Затем обнажите череп животного и обрежьте оставшиеся мышцы.

Затем снимите спинную поверхность черепа с помощью ронжеров и обрежьте боковые стороны. Впоследствии, с помощью шпателя, разрежьте обонятельные луковицы и нервные соединения вдоль вентральной поверхности мозга перед его удалением. Быстро перенесите мозг в стакан, наполненный ледяным, насыщенным кислородом, ACSF.

Чтобы приготовить срезы, содержащие путь MT-ACC, сделайте сагиттальный надрез на 2 мм латеральнее средней линии в каждом полушарии, чтобы отобразить подкорковую анатомию. Затем сделайте поперечный разрез под углом параллельно видимому волокнистому тракту в полосатом теле. Сделайте второй поперечный разрез под углом от соединения между мозжечком и зрительной корой до средней точки между передней спайкой и зрительным трактом, которые являются вентральными и параллельными пути таламуса поясной извилины.

После этого прикрепите мозговой блок к угловой пластине с помощью цианоакрилатного клея. Сделайте надрез чуть выше точки поворота дорожки. После этого разверните пластину, расплющите ее и приклейте к камерному столу вибратома.

Затем разрежьте срезы мозга толщиной 500 микрометров и храните их в ледяном кислороде ACSF. Перенесите кусочек в записывающую камеру при температуре 32 градуса Цельсия с непрерывным поступлением кислорода в ACSF в течение одного часа. Подтвердите размещение преобразователя MEA в многоканальной системе.

Используйте одну трубку для направления ACSF в камеру MEA, а другую трубку — для вывода ACSF из камеры. Непрерывно перфузируйте препарат теплым, насыщенным кислородом ACSF при температуре 30 градусов Цельсия. С помощью влажной ватной палочки перенесите срез мозга в MEA.

Осторожно переместите срез мозга, чтобы сориентировать ACC над электродами, затем стабилизируйте срез мозга с помощью анкера для среза, чтобы обеспечить хорошее электрическое соединение между срезом и электродами. После этого поместите анодный электрод проксимальнее ACC, а катодный электрод дистальнее ACC. Запишите напряженность поля по двум ориентациям поля MEA.

Затем подайте электрические токи с помощью стимулятора. Отрегулируйте расстояние между двумя электродами из хлорида серебра примерно на 1,5-2 см и отрегулируйте силу тока стимуляторов так, чтобы DCS составляла от 0,5 до 2 миллиампер. При этой процедуре поместите вольфрамовый электрод в МТ и подайте импульсы от стимулятора в таламическую область среза.

Затем используйте различные интенсивности тока, чтобы определить пороговое значение, которое вызывает отклик ACC. Переместите вольфрамовый электрод по поясной извилине таламуса, чтобы получить оптимальный профиль отклика. Запишите 1-20 ответов ACC и используйте программное обеспечение для автоматического усреднения всех ответов ACC, вызванных моей стимуляцией MT.

Чтобы вызвать судорожную активность, добавьте в перфузионный раствор 250 микроляров 48P и 5 микромоль бикукулина и продолжайте обильно разбивать срез в течение двух-трех часов. Поддерживайте относительно высокую скорость перфузии в насосе, что может помочь предотвратить накопление градиента pH. Затем поместите вольфрамовый электрод в положение МТ и подайте электрическую стимуляцию для получения профиля отклика ACC.

Запишите 10-20 разверток и усредните ответы. После этого замените раствор для предварительного переливания свежим ACSF, чтобы вымыть лекарства. В этой процедуре необходимо обеспечить генерацию однородных электрических полей путем пропускания токов между двумя параллельными серебряными проволоками, покрытыми хлоридом серебра, которые размещены внутри камеры MEA.

Если проблем нет, DCS должна оставаться в диапазоне от 0,5 до 2 миллиампер. Далее выключите DCS и стимулируйте таламус вольфрамовым электродом. Для получения максимальных синаптических ответов в АКК запишите 10-20 ответов, а затем усредните их.

Затем включите DCS и одновременно стимулируйте таламус. Оцените изменения амплитуды стимуляции таламуса, вызванные ответом АКК во время ДКБ. Теперь выключите DCS, добавьте в перфузионный раствор 250 микромоляров 48P и 5 микромоляров бикукулина и подождите 2-3 часа.

Если лекарства воздействуют на срез мозга, он должен вызывать корковые судорожные реакции. Затем соберите 10-20 передних поясных ответов коры головного мозга и измерьте амплитуду и продолжительность электрически вызванных реакций коры головного мозга. Гнездитесь, включайте DCS и одновременно стимулируйте таламус.

Оцените изменения амплитуды и продолжительности вызванных корковых судорожных реакций во время применения ДКБ. После этого замените перфузионный раствор свежим АКСФ, чтобы вымыть препараты. На этом рисунке показаны различные вызванные реакции, которые включают в себя вызванные стимуляцией таламуса реакции при АКК, вызванную лекарствами, судорожную активность, а также стимуляцию таламуса и вызванную лекарством судорожную активность.

На этом рисунке показано влияние различных ориентаций при ДКБ, таких как различные ориентации в электрическом поле, стимуляция таламусом вызываемых реакций на ДКБ и влияние катодальных ДКБ на судорожную активность. И на этом рисунке показано, что 15 минут катодального ДКБ эффективно индуцировали долгосрочную депрессию и вызванные депрессией реакции. Продолжительность приступов значительно уменьшалась после 15 минут катодального ДКБ по сравнению с отсутствием применения ДКБ.

быстрее, технически это можно сделать за четыре часа, если все выполнить правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие процедуры, такие как транскраниальная магнитная стимуляция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как предоставление неинвазивных подходов к контролю резистентных припадков. После этой разработки этот метод проложил путь для исследователей в области неинвазивной терапии к изучению лечения судорог на животных моделях.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать текущую стимуляцию для оценки судорожной активности в срезах мозга.