Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Общая цель этой миниатюрной гликановой матрицы заключается в анализе специфичности и авидности гемагглютининов вируса гриппа А. Этот анализ может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся связывания рецепторов вируса гриппа А и авидности. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в рамках одного анализа мы можем рассмотреть специфичность, а также относительную авидность связывания, что обычно не достигается в типичных анализах на основе гликановых матриц и планшетов.

Этот протокол начинается с подготовки образцов гликанов. Базовым раствором для гликанов является буфер для печати, который после изготовления следует медленно титровать до pH 8,5, а затем добавлять поверхностно-активное вещество. С помощью подготовленного печатного буфера разбавьте конъюгированные с ПАА гликаны до 100 мкг на миллилитр.

Затем разбавьте моновалентные гликаны до 100 микромоляров также в печатном буфере. Наконец, сделайте рабочие запасы амино-функционализированных красителей на одном микромоляре. Теперь загрузите десять микролитров каждого образца гликана в лунку 384-луночного микротитрового планшета.

Этого решения достаточно для печати пяти слайдов. Также перенесите десять микролитров красителя в одну лунку печатной формы. Подготовьтесь к печати массивов, сначала расположив штифты массива и печатающую головку в соответствии с компоновкой.

В этом случае одним контактом можно напечатать все образцы. Массивы гликанов напечатаны блоками по шесть штук, окруженными со всех сторон пустым местом. Наденьте перчатки, чтобы справиться с горками.

Распакуйте их и сдуйте любой мусор с поверхности с помощью газообразного азота сверхвысокой чистоты. Затем расположите слайды покрытой стороной вверх на столике для установки массивов. Затем запрограммируйте массив.

В этом случае запрограммируйте 27 точек за один визит к исходной пластине. Три предварительно нанесенных пятна на нематрицу предметного стекла, покрытого поли-L-лизином, используются для удаления излишков жидкости на кончике штифта. Остальные 24 точки на визит используются для размещения шести точек в четырех реплицируемых массивах.

Подробности указаны в текстовом протоколе. Теперь загрузите многолуночные пластины в принтер и начните печать массивов. Во время печати следите за тем, чтобы влажность держалась в пределах от 55 до 65%. Обратите внимание на внешний вид предварительных пятен на предметных стеклах с поли-L-лизиновым покрытием.

После печати визуально осмотрите каждый слайд. Проверьте правильность выравнивания пятен в пределах тефлоновых границ, что очень важно, и проверьте правильное количество пятнистых элементов. Чтобы помочь гомогенизировать прикрепление точек, поместите напечатанные слайды в камеру со 100% влажностью напечатанной стороной вверх сразу после их изготовления.

Используйте влажные бумажные полотенца, чтобы выстелить контейнер и импровизированную стойку. Заверните камеру в полиэтилен, чтобы не допустить попадания влаги. Через полчаса снимите горки.

Затем пронумеруйте предметные стекла маркером, устойчивым к растворителям, и храните их в коробке для сушки на ночь. На следующий день приготовьте свежий запас блокирующего буфера при энергичном перемешивании. Отрегулируйте pH 9,2 с помощью концентрированного гидроксида натрия.

Затем выдержите предметные стекла в буфере в течение часа. Чтобы снять блок, промойте предметные стекла в воде двойной дистилляции. Затем перенесите слайды в держатели для витражей для стекла и загрузите держатели в держатель качающейся пластины, чтобы вращать слайды при температуре 10 G в течение пяти минут.

После высыхания, при необходимости, храните предметные стекла при температуре минус 20 градусов Цельсия в герметичных пластиковых пакетах. В процессе подготовки сделайте еще одну камеру увлажнения, как и раньше. Для обнаружения иммобилизованных гликанов готовят биотинилированные лектины SNA и ECA в концентрации 10 мкг на миллилитр в зондирующем буфере и добавляют два мкг на миллилитр стрептавидина 555 в каждое разведение.

Чтобы окрашивать гемагглютининами, приготовьте 20 мкг на миллилитр раствор прекомплексного антитела в блокирующем буфере в молярном соотношении четыре к двум к одному, как описано в текстовом протоколе. Перелейте 20 микролитров приготовленных растворов в лунки 384-луночной пластины. Затем последовательно разведите лектины и гемагглютинины один к одному в соответствующих буферах.

Сделайте восемь разведений, заполнив каждую лунку 10 микролитрами образца и 10 микролитрами буфера. Теперь инкубируйте тарелку на льду в течение 30 минут. Теперь добавьте по восемь микролитров каждого разбавления в одну из 48 микролунок на распечатанном предметном стекле.

Затем подготовленное предметное стекло инкубировать в камере увлажнения в течение 90 минут. Через 90 минут промойте предметное стекло, придерживая его от края; Окуните его в PBS-T четыре раза, затем окуните в PBS четыре раза и, наконец, окуните в деионизированную воду четыре раза. Теперь высушите предметное стекло, как и раньше.

После отжима сразу же отсканируйте предметное стекло. Обязательно аккуратно загрузите предметное стекло в сканер в правильной ориентации. Используя малую мощность лазера в пять милливатт, итерационно сканируйте предметные стекла, постепенно увеличивая усиление от 25 до 75%. Оптимизируя настройки сканирования, имейте в виду, что флуорофоры будут выцветать при повторном сканировании.

Проанализируйте сохраненное изображение на предмет привязки сигналов с помощью соответствующего программного обеспечения. Может быть загружен список массивов, который имеет шаблон обнаружения. Наложите его на скан, чтобы упростить навигацию по размещению маркеров сетки.

Затем используйте программное обеспечение для анализа интенсивности пятен и сохраните результаты в виде текстового файла с разделителями табуляции для экспорта в электронную таблицу или другой статистический пакет. Проанализируйте данные, вычислив среднюю интенсивность сигнала за вычетом фона. Возьмите в среднем четыре из шести повторяющихся пятен для каждого образца, исключив самый высокий сигнал и самый низкий сигнал.

Затем постройте линейный график среднего среднего сигнала за вычетом фона по отношению к восьми концентрациям белка. Сгладьте полученную линию с помощью нелинейной регрессии. С помощью матрицы ПАА оценивали рецепторную специфичность гемагглютининов вируса гриппа А.

Массив включал несиалированные контрольные элементы в тех же микролунках. В качестве положительного контроля использовали растительные лектины с известными специфичными для печатаемых соединений свойствами. ЭКА-лектин связывался с концевой галактозой бета 1-4, связанной с анацетилглюкозамином, и не связывался с тем же соединением, если терминальная галактоза была покрыта сиаловой кислотой.

Для тестирования альфа-2-6 связанной сиаловой кислоты использовали лектин SNA. Как и ожидалось, SNA связывается только с альфа-2-6 связанными сиаловыми кислотами, но с заметными различиями в сродстве к ПАА-сцепленным и не-ПАА-сцепленным повторам красителей lacNAc. Затем был протестирован гемагглютинин H5, полученный из вируса Vietnam/1203/04, который распознает только альфа-2-3 связанные сиаловые кислоты.

Профиль связывания гемагглютинина H5 показал ожидаемую специфичность с более высокой авидностью для структур, связанных с ПАА. Наконец, был протестирован гемагглютинин H1 из сезонного штамма H1N1 человека. Как и ожидалось, этот гемагглютинин связывается только с альфа-2-6 связанными структурами, содержащими сиаловую кислоту.

После освоения этого метода можно выявить специфичность связывания и относительную авидность вирусов гриппа в рамках одного анализа. Этот метод значительно повысит эффективность анализов связывания гриппа, а также снизит потребление ценных биологических препаратов.