Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Общая цель данного миниатюризированного гликан-массива заключается в анализе специфичности и авидности гемагглютининов вируса гриппа А. Этот анализ позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся связывания рецепторов и авидности вируса гриппа А. Основным преимуществом данного метода является возможность в рамках одного анализа определить как специфичность, так и относительную авидность связывания, что обычно недостижимо при использовании типичных гликан-массивов и планшетных анализов.

Данный протокол начинается с подготовки образцов гликанов. В качестве базового раствора для гликанов используется стоковый буфер для печати, который после приготовления следует медленно титровать до pH 8.5, а затем добавить поверхностно-активное вещество. Используя приготовленный буфер для печати, разведите конъюгированные с PAA гликаны до концентрации 100 µg/mL.

Затем разведите моновалентные гликаны в буфере для печати до концентрации 100 micromolar. В завершение приготовьте рабочие стоки красителей с аминной функционализацией в концентрации one micromolar. Теперь внесите по ten microliters каждого образца гликана в лунку микротитрационного планшета на 384 лунки.

Этого объема раствора достаточно для печати пяти предметных стекол. Также перенесите 10 µL красителя-маркера в одну лунку планшета для печати. Подготовьтесь к печати микрочипов, предварительно установив иглы arrayer-а и печатающую головку в соответствии со схемой расположения.

В данном случае один пин может быть использован для печати всех образцов. Массивы гликанов печатаются блоками по шесть, окруженными пустыми местами со всех сторон. Для работы со стеклами наденьте перчатки.

Распакуйте их и сдуйте любые частицы с их поверхностей струей азота сверхвысокой чистоты. Затем поместите предметные стекла на платформу прибора для создания микрочипов (arrayer) покрытой стороной вверх. После этого запрограммируйте прибор.

В данном случае запрограммируйте нанесение 27 точек при каждом посещении исходного планшета. Три предварительных точки, наносимые на область предметного стекла с покрытием из поли-L-лизина вне области массива, используются для удаления излишков жидкости с кончика пина. Остальные 24 точки при каждом посещении пина используются для нанесения шести точек в четырех повторных массивах.

Подробные инструкции приведены в текстовом протоколе. Теперь поместите многолуночные планшеты в принтер и начните печать массивов. Во время печати следите за тем, чтобы влажность оставалась в пределах от 55 до 65%. Обращайте внимание на внешний вид предварительных пятен на предметных стеклах, покрытых поли-L-лизином.

После печати проведите визуальный осмотр каждого предметного стекла. Убедитесь в правильном расположении пятен относительно тефлоновых границ, что имеет критически важное значение, и проверьте соответствие количества нанесенных элементов. Чтобы обеспечить однородность прикрепления точек, сразу после изготовления поместите предметные стекла с напечатанной стороной вверх в камеру со 100% влажностью.

Застелите контейнер и самодельную стойку влажными бумажными полотенцами. Оберните камеру пластиком, чтобы удержать влагу. Через полчаса извлеките предметные стекла.

Затем пронумеруйте стекла маркером, стойким к растворителям, и поместите их в эксикатор на ночь. На следующий день приготовьте свежую порцию блокирующего буфера при интенсивном перемешивании. Доведите pH до 9.2 с помощью концентрированного гидроксида натрия.

Затем инкубируйте предметные стекла в буфере в течение одного часа. Для удаления блокирующего раствора промойте стекла дважды дистиллированной водой. Затем перенесите стекла в стеклянные держатели для окрашивания и поместите их в центрифужный держатель для пластин, чтобы просушить стекла центрифугированием при 10 G в течение пяти минут.

После высыхания при необходимости храните предметные стекла при -20 °C в герметичных пластиковых пакетах. Для подготовки создайте еще одну увлажняющую камеру, как описано ранее. Для обнаружения иммобилизованных гликанов приготовьте биотинилированные лектины SNA и ECA в концентрации 10 µg/mL в буфере для зондирования и добавьте по 2 µg/mL стрептавидина 555 в каждый разведение.

Для окрашивания гемагглютининами приготовьте раствор предварительно сформированного комплекса антител в блокирующем буфере с концентрацией 20 microgram per milliliter и молярным соотношением четыре к двум к одному, как описано в текстовом протоколе. Перенесите по 20 microliters приготовленных растворов в лунки планшета на 384 лунки. Затем проведите серийное разведение лектинов и гемагглютининов в соотношении один к одному в соответствующих буферах.

Приготовьте восемь разведений, наполнив каждую лунку 10 µL образца и 10 µL буфера. Инкубируйте планшет на льду в течение 30 минут. Затем перенесите по 8 µL каждого разведения в одну из 48 микролунок на распечатанном слайде.

Затем инкубируйте подготовленный предметный стекло в увлажняющей камере в течение 90 минут. По истечении 90 минут промойте предметное стекло, удерживая его за край; четырежды погрузите его в PBS-T, затем четырежды в PBS и, наконец, четырежды в деионизированную воду. После этого высушите предметное стекло центрифугированием, как описано ранее.

После центрифугирования и высушивания немедленно просканируйте предметное стекло. Убедитесь, что стекло аккуратно помещено в сканер в правильной ориентации. Используя низкую мощность лазера 5 mW, проведите итерационное сканирование стекол, постепенно увеличивая усиление с 25 до 75%. При оптимизации настроек сканирования учитывайте, что при повторных сканированиях флуорофоры будут выгорать.

Проанализируйте сохраненное изображение на наличие сигналов связывания с помощью соответствующего программного обеспечения. Можно загрузить список массивов с шаблоном нанесения точек. Наложите его на скан, чтобы облегчить навигацию по расположению маркеров сетки.

Затем с помощью программного обеспечения проанализируйте интенсивность пятен и сохраните результаты в виде текстового файла с разделителями-табуляциями для последующего экспорта в электронную таблицу или другой статистический пакет. Проанализируйте данные, вычислив среднюю интенсивность сигнала за вычетом фонового значения. Для каждого образца рассчитайте среднее значение по четырем из шести повторных пятен, исключив самое высокое и самое низкое значения сигнала.

Затем постройте линейный график зависимости среднего значения сигнала за вычетом фона от восьми концентраций белка. Сгладьте полученную линию с помощью нелинейной регрессии. Массив PAA использовался для оценки специфичности связывания рецепторов гемагглютининами вируса гриппа А.

Массив включал несиалированные контроли в тех же микролунках. В качестве положительных контролей использовали лектины растений с известной специфичностью к напечатанным соединениям. Лектин ECA связывался с терминальной галактозой с β1-4 связью с N-ацетилглюкозамином и не связывался с тем же соединением, если терминальная галактоза была перекрыта сиаловой кислотой.

Для анализа α 2-6-связанной сиаловой кислоты использовали лектин SNA. Как и ожидалось, SNA связывался только с α 2-6-связанными сиаловыми кислотами, однако наблюдались заметные различия в сродстве к лакNAc-повторам с присоединенным красителем, связанным с PAA, и не связанным с PAA. Затем был протестирован гемагглютинин H5, полученный из вируса Vietnam/1203/04, который распознает только α 2-3-связанные сиаловые кислоты.

Профиль связывания гемагглютинина H5 продемонстрировал ожидаемую специфичность с более высокой авидностью к структурам с α2-3-связями. В завершение было проведено тестирование гемагглютинина H1 из сезонного человеческого штамма H1N1. Как и ожидалось, данный гемагглютинин связывался только со структурами, содержащими сиаловые кислоты с α2-6-связями.

После освоения эта методика позволит определять специфичность связывания и относительную авидность вирусов гриппа в рамках одного анализа. Данный метод значительно повысит эффективность анализов связывания вирусов гриппа, а также позволит сократить расход ценных биологических материалов.