Обызвествление сосудистых гладких мышечных клеток и визуализации аортальной кальцификации и Воспаление

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации кальцификации аортальных сосудов ex vivo и моделировании кальцификации сосудов in vivo с использованием культивируемых первичных гладкомышечных клеток аорты мыши. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии сосудистых заболеваний, предоставляя модель in vitro для изучения молекулярных механизмов кальцификации сосудов, а также позволяя оценивать кальцификацию сосудов и воспаление макрофагов in vivo. Основным преимуществом данного метода является возможность чувствительного количественного определения и колокализации активности макрофагов с отложениями кальция в атеросклеротических бляшках даже на ранних стадиях заболевания.

Помимо Кейтлин и меня, эту процедуру будет демонстрировать Роберт Тейнш, техник нашей лаборатории. Для начала процедуры продезинфицируйте хвост спиртовой салфеткой и найдите боковые хвостовые вены. Затем, при легком направлении поршня шприца вперед, введите иглу калибра 30G в хвост до тех пор, пока она не пройдет без сопротивления.

Затем медленно введите 100 мкл кальциевого NIR-красителя и/или 100 мкл катепсинового NIR-красителя с постоянной скоростью. Извлеките иглу через пять секунд и извлеките аорты через 3–24 часа после инъекции. Под диссекционным микроскопом удалите брюшину, чтобы открыть органы брюшной полости.

Затем удалите органы желудочно-кишечного тракта, стараясь не пересечь аорту. После этого сделайте латеральный разрез передней части диафрагмы и продолжите разрез по брюшной полости. С помощью диссекционных ножниц освободите грудную клетку, разрезав ребра по бокам и удалив мягкие ткани, прилегающие к верхней части грудины.

Затем удалите грудную клетку, чтобы обнажить легкие. Осторожно извлеките легкие. Далее аккуратно удалите трахею и пищевод, следя за тем, чтобы аорта оставалась неповрежденной.

Затем удалите мягкие ткани, окружающие аорту, от подвздошной бифуркации до дуги аорты. Будьте осторожны при удалении периаортального жира. После этого удалите оставшийся жир и мягкие ткани, окружающие грудную аорту и крупные ветви дуги аорты.

Затем удалите тимус. Теперь извлеките сердце из грудной полости, осторожно отделив его от проксимальной части аорты. Затем перережьте дистальную часть аорты в области подвздошной бифуркации.

С помощью инсулиновой иглы введите физиологический раствор в аорту через аортальную дугу, чтобы вымыть оставшиеся клетки крови. Отделите аорту вместе с сосудами аортальной дуги и полностью извлеките ее из организма. Поместите аорту в физиологический раствор на льду до начала визуализации.

На данном этапе поместите аорты в холодный раствор HBSS до завершения препарирования. В стерильном ламинарном шкафу перенесите аорты в раствор для переваривания аорты в чашки для культивирования тканей размером 35 X 10 миллиметров. Затем инкубируйте их при 37 °C в течение 30 минут при осторожном перемешивании на качалке.

После переваривания аорты должны приобрести растянутый или разволокненный вид. Под диссекционным микроскопом удалите внешний адвентициальный слой аорты, сохраняя при этом целостность медии. Для этого отделите внешний слой аорты на одном конце и снимите его с нижележащего медиального слоя по принципу снимаемого носка.

После удаления адвентициального слоя инкубируйте оставшуюся часть аорты в новой культуральной чашке с питательной сределём для культур клеток при 37 °C в течение двух-четырех часов. Затем разрежьте аорту на кольца шириной 1–2 мм. Перенесите кольца в новую чашку для культивирования тканей с раствором для дигестии аорты и инкубируйте при 37 °C в течение 120 минут, аккуратно перемешивая методом периодического покачивания.

Во время инкубации несколько раз втягивайте и вытесняйте раствор пипеткой для ресуспендирования клеток. После этого добавьте пять миллилитров подогретой среды для культивирования клеток в раствор для дигестии и перенесите его в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 200 G. Затем аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в нужном объеме среды для культивирования клеток.

Для индукции кальцификации гладкомышечных клеток сосудов перенесите клетки в 6-луночный культуральный планшет и дайте им прикрепиться. Затем замените среду на среду для кальцификации. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение как минимум семи дней.

После этого аспирируйте среду из планшета для культивирования клеток. Один раз промойте клетки в ионизированной воде. Зафиксируйте клетки, поместив их в 1 мл 10% формалина при комнатной температуре на 20 минут.

Затем удалите формалин и промывайте фиксированные клетки дистиллированной водой в течение пяти минут. Далее инкубируйте клетки в одном миллилитре 5% раствора нитрата серебра под лампой мощностью от 60 до 100 Вт в течение одного-двух часов. После этого аспирируйте раствор нитрата серебра и промойте клетки дистиллированной водой в течение пяти минут.

Через пять минут удалите непрореагировавшее серебро, поместив клетки в 1 мл 5% раствора тиосульфата натрия в дистиллированной воде на пять минут. Затем промойте клетки дистиллированной водой в течение пяти минут. Клетки, окрашенные методом фон Косса, теперь готовы к визуализации с помощью стандартной инвертированной световой микроскопии.

На этом рисунке показаны мыши дикого типа, мыши с нокаутом MGP и мыши с нокаутом LDLR, которым в хвост вводили кальциевый NIR и катепсин NIR; через 24 часа была произведена выемка аорт с последующей оценкой методом NIR-флуоресцентной визуализации. У мышей дикого типа практически не наблюдается кальцификации аорты или присутствия макрофагов. Аорты мышей с нокаутом LDLR характеризуются обширной кальцификацией, которая колокализуется с накоплением макрофагов.

Напротив, у мышей с нокаутом MGP наблюдается кальцификация аорты, которая происходит в отсутствие инфильтрации макрофагов. В данном эксперименте из мышей с нокаутом MGP были выделены культивируемые гладкомышечные клетки сосудов (ГМКС) аорты, которые затем инфицировали аденовирусом, экспрессирующим либо GFP, либо MGP. ГМКС аорты, выделенные из мышей дикого типа, трансфицировали либо контрольной скремблированной siRNA, либо siRNA, нацеленной на MGP.

Клетки выращивали в среде для кальцификации A в течение семи дней, после чего их фиксировали и окрашивали методом фон Косса. Количественную оценку окрашивания на кальций проводили с помощью программного обеспечения ImageJ после вычитания фона. После разработки эти методы позволили ученым визуализировать атеросклероз и кальцификацию сосудов ex vivo.

А также для моделирования кальцификации сосудов in vitro. Это открывает возможность тестирования воздействия новых лекарственных препаратов на сосудистые заболевания. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать аорты для получения первичных гладкомышечных клеток аорты мыши, визуализировать атеросклеротические бляшки с помощью зондов ближнего инфракрасного флуоресцентного имиджинга и кальцифицированные гладкомышечные клетки сосудов in vitro.