Автоматизированная двухслойной липидной мембраной, Образование Использование тонкой пленки полидиметилсилоксана

Общая цель данной процедуры заключается в описании метода, который может быть использован для изучения автоматизированного формирования липидного бислоя с использованием тонкой пленки полидиметилсилоксана. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нанобиосенсоров, касающиеся мембранно-белковых взаимодействий. Основное преимущество этого метода заключается в том, что образование липидного бислоя автоматизировано и воспроизводимо.

Для начала приготовьте буферный раствор, соединив хлорид калия, трис гидрохлорид и ЭДТА в дистиллированной воде. Затем отрегулируйте PH раствора до 8,0. Затем отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 микрона, и автоклавируйте раствор при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут.

Далее приготовьте липидный раствор для предварительной окраски, растворив 3% липида в смеси, состоящей из двух частей ундекана и восьми частей гексадекана по объему. Размешайте раствор на ночь с помощью ротатора. Кроме того, приготовьте липидный раствор для формирования мембраны, растворив 0,1% липида в той же смеси из двух частей ундекана и восьми частей гексадекана по объему.

Перемешайте этот раствор на ночь также на ротаторе. Чтобы приготовить тонкую пленку PDMS, смешайте девять частей преполимера с одной частью отвердителя в чашке для смешивания. Поместите пять граммов этой смеси в чашку Петри и вращайте чашку со скоростью 800 об/мин в течение 10 секунд, чтобы образовалась пленка толщиной от 200 до 250 микрон.

Затем поместите чашку Петри в вакуумный эксикатор и потяните вакуум со скоростью 100 миллиторр в течение двух часов, чтобы удалить остаточные пузырьки воздуха. Затем запекайте тонкую пленку в духовке в течение пяти часов при температуре 70 градусов Цельсия, чтобы полимеризовать PDMS. После охлаждения разрежьте полимеризованную тонкую пленку на квадраты размером два сантиметра на два сантиметра и с помощью перфоратора диаметром 500 микрон сделайте небольшое отверстие в центре квадрата.

Затем с помощью микропипетки предварительно закрасьте отверстия одним микролитром 3%-ного липидного раствора. Чтобы создать камеру с черной липидной мембраной, спроектируйте два симметричных блока для камеры с помощью программного обеспечения для 3D-рисования. Затем изготовьте камеру с помощью блока из ПТФЭ и станка с ЧПУ.

Чтобы собрать камеру, поместите предварительно окрашенную тонкую пленку PDMS между двумя блоками из ПТФЭ таким образом, чтобы отверстие на тонкой пленке PDMS было центрировано по отверстию в камере. Используйте покровное стекло и вакуумную смазку для герметизации внешних краев камеры. После герметизации обездвижите собранную камеру с помощью гаек и болтов.

Важно убедиться, что камера хорошо герметизирована, чтобы не было утечки жидкости. С помощью пипетки нанесите 0,5 микролитра 0,1%-ного липидного раствора на отверстие тонкой пленки PDMS, собранной с камерой. Затем поместите камеру в охлажденную среду при температуре ниже 10 градусов Цельсия и храните ее до тех пор, пока она не понадобится.

Чтобы при ускоренной самостоятельной сборке образовалась черная липидная мембрана, извлеките камеру из холодильника и добавьте по два миллилитра буферного раствора в каждую сторону камеры. Отставьте камеру в сторону на 10 минут, пока застывший мембранный предшественник не оттает. Затем поместите камеру на микроманипулятор для точного контроля угла возвышения относительно источника света и микроскопа.

С помощью галогенного оптоволоконного осветителя осветите одну сторону камеры, чтобы сделать апертуру тонкой пленки PDMS ярче. С другой стороны, поместите 20-кратный объектив на одну линию с отверстием и наблюдайте за центром, где цвет становится ярче, чем кольцо. Для проведения электрических измерений подготовьте электроды из хлорида серебра, поместив серебряную проволоку толщиной 208 мкм в раствор гипохлорита натрия не менее чем на одну минуту.

Далее подключите электроды к микроэлектродному усилителю. Затем поместите электроды из хлорида серебра в каждую сторону камеры так, чтобы они оказались в буферном растворе. Используя программное обеспечение для электрофизиологии, подайте треугольную волну с напряжением 10 милливольт на мембрану, чтобы получить прямоугольную волну.

Запишите электрические свойства мембраны, нажав кнопку записи. Продолжайте запись до тех пор, пока не будет наблюдаться равномерная прямоугольная волна. Затем завершите запись, нажав на значок черного квадрата.

Для включения грамицидина А в липидный бислой можно использовать два метода. Во-первых, грамицидин А может быть добавлен непосредственно в липидный раствор перед нанесением липидного раствора на отверстие тонкой пленки PDMS. Во-вторых, раствор грамицидина А может быть добавлен в камеру при образовании липидного бислоя.

Чтобы наблюдать за активностью канала грамицидина А, подайте напряжение 100 милливольт на мембрану с частотой дискретизации 5 килогерц, чтобы измерить удерживающий потенциал мембраны. Запишите электрические свойства, как это было сделано ранее, нажав кнопку записи. По мере отображения активности ионных каналов продолжайте запись до тех пор, пока не будут замечены различные скачки тока, чтобы подтвердить включение ионного канала.

После подтверждения закройте запись, щелкнув значок черного квадрата. Когда запись будет завершена, отфильтруйте данные с помощью фильтра нижних частот Бесселя с частотой 100 Гц с помощью электрофизиологического программного обеспечения. Наблюдайте за текущими скачками в отфильтрованных данных о потенциале удержания.

Эти скачки представляют собой димеризацию ионного канала грамицидина А. Когда замороженный мембранный предшественник был доведен до комнатной температуры для оттаивания, образование липидного бислоя облегчается за счет экстракции гидрофобного растворителя в тонкую пленку PDMS. Эта последовательность изображений показывает образование липидного бислоя, который самособирается при нагревании из своей замороженной формы.

Здесь электрическая проводимость иллюстрирует включение и димеризацию грамицидина А. При димеризации грамицидин А образует ионный канал, и уровни проводимости подскакивают до 28 пикосименсов, что согласуется с результатами предыдущих исследований и свидетельствует о немедленном включении этого антибиотика в бислой. Наша технология формирования мембран является мощным инструментом для исследований клеточных мембран и наноканалов, в отличие от традиционных методов, которые имеют ограниченные возможности для практического применения. Наша система не требует специальных знаний ни для формирования мембраны, ни для включения ионных каналов, что делает ее хорошо подходящей для скрининга лекарственных препаратов и биозондирования.