Формирование биомембрана Microarrays с Ракель основе метода Ассамблеи

Общая цель этой процедуры заключается в создании биомембранных микрочипов с использованием простого метода препарирования. Это достигается путем первого покрытия гранул диоксида кремния липидными бислойными мембранами. Вторым этапом процедуры является нанесение покрытых липидами шариков на силиконовую микролуночную подложку.

Третий шаг – удаление шариков не в микролунках, с помощью полиметилсубоксанового скребка. Заключительным этапом является визуализация матриц липидного покрытия с помощью флуоресцентной микроскопии. В конечном счете, этот метод может быть использован для определения констант связывания для липидных взаимодействий токсинов с использованием метода матричной визуализации.

Этот метод может быть использован для создания массивов сферических липидных бислоев и частиц естественных мембран, полученных из клеток. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что помимо изготовления микролунок, она не требует химической модификации ни субстрата, ни липидных мембран для создания пространственно определенных биомембранных массивов. Применение этого метода может быть расширено до безметочного детектирования взаимодействий липидных белков с использованием поверхностной плазмы и резонанса на основе нанометрических металлических отверстий.

Несмотря на то, что этот метод может дать представление о взаимодействиях липидных белков, он также может быть применен к другим системам, таким как исследования клеточной фокальной адгезии, массивы микролунок и препараты ракеля, подробно описанные в текстовом протоколе. Это видео начинается с подготовки везикул. Сначала в небольшой стеклянный флакон смешайте компонент липиды для пузырьков.

Всего полмиллиграмм липида находится в таком растворе под вакуумом для сушки смеси в течение шести часов. Далее делают 0,1 молярного раствора хлорида натрия и добавляют к высушенным липидам полмиллитра. Дайте смеси понервироваться в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день сделайте вихревую смесь для суспензии пузырьков. Затем обработать полученную смесь ультразвуком в течение 20 минут на бане, облучать ультразвуком при комнатной температуре. После ультразвуковой обработки суспензию выдавить через 100-нанометровый мембранный фильтр из поликарбоната.

Пропустите суспензию через экструзионный фильтр в общей сложности 17 раз. Затем храните экструдированные пузырьки в стеклянном флаконе при температуре четыре градуса Цельсия. Сначала с использованием шариков диоксида кремния диаметром 700 нанометров.

Сделайте суспензию из 15 миллиардов бусин в 0,1 моляра натрия хлорида. Сделайте вихревую нагрузку на суспензию, а затем центрифугируйте ее при 1700 G в течение 20 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите промывку ресусом, подвесив бусины еще в одном миллилитре раствора соли и открутив их еще на 20 минут.

Затем повторите процесс в третий раз, чтобы получить сферические липидные бислои или SSB. Смешайте 25 микролитров суспензии гранул диоксида кремния с 200 микролитрами везикулной суспензии из предыдущего раздела. Вихревую смесь и зажгли ее, инкубируют при комнатной температуре в течение часа, центрифугируют смесь при 1700 G в течение 20 минут.

Выбросьте надосадочную жидкость. Гранула розового цвета до разорванных пузырьков с рядом DPPE на бусинах. Ресуспендируйте его в 225 микролитрах PBS при PH 7,4.

Повторите шаги вращения и реактивной суспензии дважды, чтобы удалить неразорвавшиеся везикулы и завершить создание SSB. Разделите пластины массивов микролунок на прямоугольные части по четыре-шесть массивов в каждой. Далее вортекс, суспензию SSLB из предыдущего участка и передаем по 10 микролитров в каждый микролуночный массив.

Подождите час, пока SSB установятся позже. Аккуратно промойте чипы массива с помощью PBS и погрузите массив в PBS, используя скольжение ракеля по поверхности погруженных чипов пять раз. При этом SLP удаляются не внутри микролунок.

Затем обхватите каждую микросхему массива пинцетом и аккуратно стряхните PBS. Затем переложите его в свежую ванну PBS. Верхние поверхности стружки должны оставаться влажными.

Выньте скол из ванны и уберите W. Большая часть PBS с лабораторной салфеткой. Оставьте достаточное количество PBS, чтобы поддерживать увлажнение массива.

Теперь добавьте 200 микролитров раствора BSA в матрицу, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Дайте массиву инкубироваться в течение часа. Позже извлеките БСА из увлажненной коробки с помощью микропипетки и добавьте 200 микролитров раствора холерного токсина.

Затем верните массив во увлажненную камеру. Подождите еще час, затем промойте массив с помощью PBS и удалите излишки PBS с помощью салфетки для коленей. Затем поместите чип матрицы на стандартное предметное стекло для микроскопии, прикрепите к нему квадратную крышку размером 24 на 40 миллиметров и приступайте к визуализации.

Анализ изображений может быть выполнен с помощью функций анализа частиц изображения J.Automated particle analysis. Затем для каждого массива суммируйте средние интенсивности отдельных SSB в виде гистограмм. После использования описанных методов квадратная область размером 100 микрон на массиве показывает 936 SSB.

В то время как были рассчитаны данные о заполненности и построена гистограмма интенсивности флуоресценции SSLB после недели хранения. Та же решетка была повторно проанализирована таким же образом, и не было никаких изменений в интенсивности флуоресценции или заполненности решетки. Последовательное осаждение различных SSB с различными идентифицирующими маркерами также было возможно с помощью описанных методов.

Вторые SSB были сданы на хранение в один 10-й. Концентрация первых SSB. Для эксперимента показано наложение обоих маркеров.

Матрицы были изготовлены из SSB с различными концентрациями GM One и подвергались воздействию фиксированной концентрации холерного токсина. Обратный метод также был выполнен для определения константы диссоциации равновесия. Для GM one.

Массивы для связывания холерного токсина также могут быть изготовлены из природных биомембран, таких как этот массив из частиц миелина. Он помечен липофильным флюором четыре FM 1:43. Липидные рафты обогащены холестерином и ганглиозидами, такими как GM-один.

Таким образом, конъюгированный холерный токсин Alexa 4 88 прочно связывается с липидными рафт-микрочипами, в отличие от флуоресцентно меченного полосатого Адена, не связывается с этими массивами. Массив был изготовлен путем доставки миелиновых и липидных плотов в микроскважины через микрофлюидный чип с каналами 250 микрон. Он был помечен антиолигодендроцитами IgM, а сульфид S, обнаруженный в миелине, был помечен, но липидные плоты не были помечены.

Не сразу же подготавливаются бусины, покрытые липидным батором. Этот метод может быть использован для подготовки массивов за час, если он выполнен правильно, после создания массивов естественных мембранных частиц. Другие методы, такие как поверхностная плазма с нанодырками и резонанс, могут быть использованы для безметочного зондирования биомолекулярных взаимодействий.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать биомембранные массивы с использованием гранул, покрытых липидным слоем желчи, и натуральных мембранных частиц.