Неинвазивным и технически неинтенсивное метод индукции и Фенотипирование экспериментальной бактериальной пневмонии у мышей

Общая цель этого экспериментального протокола состоит в том, чтобы обеспечить неинвазивную и технически неинтенсивную процедуру индуцирования бактериальной пневмонии у мышей и последующую количественную оценку защитного ответа хозяина in vivo в легких. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инфекционных заболеваний и иммунологии, о генах и молекулярных путях, которые контролируют реакцию хозяина на инфекцию. Главным преимуществом данного метода инфицирования легких является его техническая простота.

Что позволяет даже лабораториям с небольшим опытом в легочных процедурах изучать легочный врожденный иммунный ответ. На предприятии второго уровня биобезопасности разморозьте запасы глицерина K.pneumoniae и перелейте один миллилитр бактерий в 500-миллилитровую колбу для культур, содержащую 50 миллилитров триптического соевого бульона. Инкубируйте культуру суспензии в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 200–225 об/мин.

На следующее утро разведите от одного до пяти миллилитров бактериальной культуры в новой колбе, содержащей 50 миллилитров триптического соевого бульона, и инкубируйте культуру в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия еще 2,5 часа, чтобы достичь логарифмической фазы. По окончании второй инкубации переложите один миллилитр бактерий из второй культуры в пробирку объемом 1,5 миллилитра для центрифугирования. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая палитру, и аккуратно ресуспендируйте бактерии в одном миллилитре стерильного физиологического раствора на три отдельных промывания.

После третьей промывки ресуспендируйте бактерии в еще одном миллилитре стерильного физиологического раствора и установите последовательные разведения инокулюма по логарифму. Отмерьте один миллилитр одного к 10 и один до 100 разведений в одноразовых кюветах, в двух экземплярах, чтобы определить OD600 отмытых K.pneumoniae. OD600 равный 1,0, примерно эквивалентен четырем-семи умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр.

После расчета концентрации бактерий в каждом разведении суспендируйте желаемую дозу инокулюма КОЕ в дозе от 50 до 60 микролитров стерильного физиологического раствора на животное-реципиента в возрасте от 8 до 12 недель. Чтобы доставить бактерии животным, наберите дозирующий инокулят в наконечник пипетки P200 и поместите мышь под наркозом в полулежачее положение лежа на спине, подвешенную за верхнечелюстные резцы, на резиновой ленте, натянутой между колышками наклонной плексигласовой доски. С помощью пары тупых щипцов без ребрышек осторожно отведите язык в сторону и введите дозу в ротовую полость животного, стараясь не травмировать язык или ротовую глотку.

Удерживая язык втянутым, аккуратно закупорьте нос пальцем в перчатке, пока домик не вдохнет два-три раза. Когда в полости рта не видно жидкости, перенесите мышь из доски для прививки в клетку в лежачем положении, чтобы предотвратить закупорку ноздрей во время восстановления мыши. Сделайте продольный разрез чуть ниже грудины.

Затем, приподняв грудину щипцами, надрезать диафрагму, позволив легкому упасть обратно в грудную полость. Продолжайте разрез вверх через грудную полость по обе стороны сосудистой сети и вверх по шее. Когда трахея будет видна, осторожно разрежьте середину шеи и раздвиньте ткань в стороны, чтобы не повредить окружающий сосудистый состав.

Теперь прорежьте трахею примерно на четверть пути вниз от головки и каудально введите канюлю, прикрепленную к одномиллилитровому шприцу, предварительно загруженному одним миллилитром PBS, в трахею. Медленно вдавливайте объем в легкие, позволяя всем долям раздуться. Затем вытяните объем обратно с помощью шприца и соберите собранные смывки в 15-миллилитровую пробирку со льдом.

В соответствующей экспериментальной конечной точке соберите кровь из левого желудочка и переложите ее в гепаринизированную трубку, чтобы избежать свертывания. Затем соберите все доли легких в 15-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров PBS, и селезенку в 15-миллилитровую пробирку, содержащую два миллилитра PBS. Затем используйте индивидуальные одноразовые гомогенизаторы для каждого образца для мацерации тканей на льду с последующим последовательным разбавлением тканевых суспензий.

Нанесите разбавления в двух экземплярах на отдельные стороны одной пластины TSA и дайте образцам ненадолго высохнуть. Затем переверните планшеты и культивируйте образцы в статическом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, усредняя колонии бактерий с обеих сторон планшета и после каждого разведения на следующее утро. При 2000 КОЕ K.pneumoniae у мышей, как правило, начинают проявляться клинические симптомы через 12-24 часа после заражения.

В течение 48-72 часов у многих животных проявляются симптомы болезни и заболеваемости, которым обычно предшествует потеря веса в среднем на 20 процентов. Доза LD50, однако, позволяет выявить как относительно повышенную, так и сниженную выживаемость в экспериментальной группе, и может быть предпочтительной для более долгосрочных исследований. Инфекция нижних дыхательных путей, вызванная K. pneumoniae, характеризуется сильным притоком лейкоцитов в дыхательные пути в течение шести часов после заражения, который достигает пика через 24 часа и в основном представлен нейтрофилами.

Цитокины обнаруживаются в жидкости бронхоальвеолярного лаважа как через 24, так и через 48 часов после инфицирования K.pneumoniae, и дают представление о микроокружении легких и его иммунной саморекрутике в ответ на бактериальную инвазию. Бактериальная нагрузка в легких, крови и селезенке также резко возрастает между 24 и 48 часами после инфекции. После освоения метод орофарингеальной аспирации инфекции легких может быть выполнен всего за одну-две минуты на мыши, если он выполнен правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя использовать чрезмерный объем аспирации. Объем от 50 до 60 микролитров обычно хорошо подходит для мышей в возрасте от 8 до 12 недель. После этой процедуры могут быть выполнены различные методы на легких и периферических тканях, чтобы обеспечить количественную оценку иммунного ответа при выведении патогена.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вызвать экспериментальную бактериальную пневмонию с помощью доставки патогена из ротоглотки и определить патогенную нагрузку у мышей. Не забывайте, что работа с микробами может быть опасной, и что при подготовке к этой процедуре всегда следует соблюдать основные меры предосторожности и практики BSL-2.