Визуализации Жизнеспособность клеток на непрозрачный строительные леса - на примере романа трикотажной Titanium Implant

Общая цель этого эксперимента заключается в визуализации микроструктуры и адгезии клеток на непрозрачном трикотажном имплантате с ядром титана с использованием методов флуоресцентной визуализации. Этот метод расширяет возможности анализа тканевой инженерии с помощью непрозрачных скаффолдов. Одним из преимуществ этого метода является то, что можно проследить жизнеспособность клеток, а также пролиферацию на каркасе с помощью определенного культурального педро-воздуха.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как флуоресцентное окрашивание и, в дальнейшем, визуализация являются сложной задачей. Индивидуальные свойства каркаса, такие как размер пор, могут повлиять на время и/или флуоресценция каркаса может повлиять на выбор флуорофоров, которые вы используете. Поместите до пяти лесов толщиной шесть или семь миллиметров в трубку объемом 50 миллилитров и промойте их водой три раза в течение 20 минут за промывку.

Делают это при комнатной температуре с легким помешиванием. Далее промойте леса в 30 миллилитрах 1%-ного раствора Triton X-100 в тех же условиях. Затем выполните еще два промывки водой.

Теперь последовательно очистите каркасы ультразвуком в реагентах 99% ацетона, 99% изопропанола и 99% этанола. Выполняйте каждый шаг ультразвуковой обработки дважды по пять минут на каждую ультразвуковую обработку. Затем обработайте скафот ультразвуком еще три раза в воде в общей сложности 15 минут.

В завершение поместите каркасы на безворсовую ткань и высушите их на воздухе в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день автоклавируйте леса в течение 15 минут при температуре 121 градус Цельсия и 15 фунтах на квадратный дюйм. Чтобы подтвердить, что очистка сработала, используйте непрямую флуоресценцию.

Загрузите одну лунку из 12-луночного планшета 2000 микролитров свежеприготовленного раствора для окрашивания серы и родамина B и с помощью щипцов перенесите в эту лунку каркас. Затем сделайте негативные изображения каркаса с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором светодиодных кубических фильтров RFP, и ищите примеси при большом увеличении. Используя шкаф биобезопасности, перенесите чистые леса в колодцы 24-луночной плиты.

Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров питательной среды с температурой 37 градусов Цельсия и дайте каркасу впитаться в течение 15 минут. Тем временем приготовьте 500 000 инфицированных Ad-GFP клеток SEP1 на 1 миллилитр среды. Через 15 минут полностью отаскайте среду от скаффолдов, и посадите их со 100 микролитрами клеточной суспензии.

Затем инкубируйте их в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. После короткой инкубации добавьте еще 500 микролитров питательной среды, и инкубируйте скаффолды в течение 24 часов. На следующий день смените питательную среду для удаления неадгезивных клеток.

Затем оцените адгезию и распространение клеток на каркасах с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором светодиодных кубических фильтров GFP. Для окрашивания живых и мертвых сначала поместите клетки SEP1 на каркас, как и раньше. Через 24-48 часов полностью отаскайте питательную среду и промойте каркасы с DPBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Теперь окрашивайте клетки с помощью питательной среды, содержащей кальцеин AM, Hoechst 33342 и гомодимер этидия. Все эти три флуорофора чувствительны к свету, поэтому жизненно важно держать клетки в темноте, двигаясь вперед. Инкубируйте клетки в течение 30 минут с флуорофорами, чтобы получить равномерное распределение по всему каркасу.

Конкретные характеристики скаффолда будут влиять на время инкубации. После инкубации трижды промойте клетки с DPBS из расчета один миллилитр на лунку. Выполняйте каждую стирку в течение пяти минут при комнатной температуре.

Сразу после промывки задокументируйте скаффолды с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы измерить жизнеспособность клеток с течением времени, используйте измерения конверсии резазурина. Во-первых, полностью аспирируйте питательную среду из клеток SEP1, сидящих в 24-луночной пластине, и промойте клетки 500 микролитрами DPBS на лунку.

Затем покройте ячейки необходимым объемом стерильного рабочего раствора резазурина и включите в него одну лунку только с резазурином. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 30 минут. После инкубации перенесите по 100 микролитров кондиционированного надосадочной жидкости из каждой лунки в планшет на 96 микролунок для измерения его флуоресценции, как описано в текстовом протоколе.

Для дальнейшего выращивания достаньте резазурин из лунки, и трижды промойте одним миллилитром DPBS. Выполняйте каждую стирку в течение пяти минут при комнатной температуре. После третьей промывки добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую лунку с клетками и продолжайте их инкубацию для дальнейших временных измерений.

С помощью непрямого флуоресцентного окрашивания были задокументированы загрязнения предварительной очистки для оптимизации протокола очистки. Значительное снижение нагрузки вещества на строительные леса свидетельствует об эффективности описанного протокола очистки. Последовательность имплантатов, используемых для лечения артропластики, определяется событиями, происходящими на границе клеточного материала.

После 24 часов прилипания к каркасам клетки SEP1 прикрепились. Затем флуорофоры были применены для изучения гибели и пролиферации клеток в течение определенного периода времени на каркасах. Окрашивание живых и мертвых показало синее ядерное окрашивание с красной флуоресценцией в мертвых клетках и зеленой флуоресценцией в жизнеспособных клетках.

Кроме того, жизнеспособность клеток на каркасе количественно оценивали с помощью анализа конверсии резазурина. В течение двух недель были собраны данные о клетках, культивируемых с помощью скаффолдов или без них. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать регулировать используемые флуорофоры в соответствии с имеющимися у вас каркасом и микроскопом.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание, чтобы визуализировать присутствие белков или активацию сигнальных каскадов. Применение этой техники распространяется и на терапию артропластики, потому что взаимодействие лица клетки с окружающей тканью in vivo определяет ее функцию и долговечность.