Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Общей целью данного эксперимента является разработка нового метода получения полученных из стволовых клеток воспаленных суставов регуляторных Т-клеток для иммунотерапии аутоиммунного артрита. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области аутоиммунных заболеваний о потенциальной иммунотерапии аутоиммунного артрита. Основное преимущество этой методики заключается в том, что регуляторные Т-клетки, полученные из стволовых клеток, являются NYPED и относятся к одному типу.

Начните с разбавления интересующих вас питающих ячеек до минимальной плотности один умножить на 10 четвертых ячеек на квадратный сантиметр в среде OP9 и нанести покрытие один раз на 10 до шестой питательной ячейки на 10-сантиметровую чашку. Когда клетки станут слитыми на 80-90%, удалите среду из культур и затравите от 0,5 до 10 до пятой, ретровирально трансдуцируемые индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки или IPSC в среду OP9 в каждой чашке. Через пять дней отсадите среду и промойте клетки 10 миллилитрами PBS.

Затем отделите клетки с четырьмя миллилитрами трипсина на чашку, при температуре 37 градусов по Цельсию. Через 10 минут остановите реакцию с восемью миллилитрами среды IPSC и вытяните клетки для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежей среды IPSC и переложите ячейки на новые 10-сантиметровые посуды.

Дайте питающим клеткам прилипнуть к пластине в течение 30 минут в инкубаторе для клеточных культур. Затем соберите плавающие IPSC и отфильтруйте трансдуцированные клетки через 70-микронный фильтр для подсчета. Высевайте пять раз по 10 до пятой IPSCs на свежую 80-90%-ную сливающуюся пластину питательных клеток в среде OP9 с добавлением Murine-Flt3-Ligand и верните культуры в инкубатор.

Через три дня с помощью пипетки объемом 10 миллилитров вымойте посуду с питательной средой. Затем добавьте в чашку пять миллилитров свежей среды OP9 и аккуратно смойте все полуадгезивные IPSC с помощью осторожного, принудительного пипетирования, которое не нарушит слой питающих клеток. Повторите промывку с 10 миллилитрами PBS, чтобы собрать последние из полуадгезивных клеток, вытягивая смывки из каждой чашки в одну коническую пробирку для каждой культуры.

После вращения клеток повторно суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах среды OP9 с добавлением Murine-Flt3-Ligand и IL-7 и отфильтруйте клетки через 70-микронный фильтр. Высейте по одной культуре IPSC на лунку в шестилуночный планшет, содержащий от 80 до 90% монослоев сливающихся питательных клеток, и верните сокультуры в инкубатор. Каждые два дня заменяйте половину среды свежей средой OP9 с добавлением Murine-Flt3-лиганда и IL-7, а каждые четыре-шесть дней повторно засевайте дифференцирующие IPSC на новые планшеты со свежим слоем питающих клеток по мере необходимости.

Начните с отделения представляющих интерес клеточных культур с помощью трипсина и повторного суспендирования каждого типа клеток в 10 миллилитрах свежей среды. Поместите каждую клеточную культуру в новую 10-сантиметровую чашку и дайте питающим клеткам прилипнуть в инкубаторе для клеточных культур. Через 30 минут соберите плавающие IPSC и пропустите культуры через отдельные клеточные фильтры 70 микрон, чтобы удалить клеточные кластеры для подсчета.

Повторно суспендируйте каждую культуру в соотношении 1,5 умно-10 до седьмой клетки на миллилитр в холодном PBS, при необходимости снова профильтруя. Затем поместите от четырех до шести недель самок мышей C57BL/6 по одной в ограничитель для мелких животных и переведите 200 микролитров одного типа клеток на мышь в хвостовую вену каждого животного. Используйте штангенциркуль стрелочного датчика для измерения отека обоих коленей, чтобы установить исходное измерение.

10 дней после переноса клеток с помощью одномиллилитрового шприца введите мышам 100 микрограммов метилированной эмульгированной БСА, эмульгированной в полном адъюванте Фрейнда у основания хвоста каждого экспериментального животного. Через 17 дней после переноса клеток вызвать артрит путем внутрисуставного введения 20 микрограммов метилированного БСА в 10 микролитров PBS в левый коленный сустав и 20 микрограммов метилированного БСА и 100 микрограммов цельного овальбумина по 10 мкл PBS в правый коленный сустав каждого животного, подвергшегося анестезии. Через семь дней после возникновения артрита снова измерьте коленные суставы для расчета процентного увеличения диаметра колена и хирургическим путем иссекайте коленную чашечку.

Зафиксируйте стыки в формалине. Затем, после декальцинации при ЭДТА, закапывают колени в парафин и получают четыре микронных среза для гистохимического окрашивания и анализа. На 28-й день антиген-специфические Т-регуляторные клетки экспрессируют значительные уровни CD3 и антиген-специфических Т-клеточных рецепторов.

Большинство из этих клеток также экспрессируют CD25, CD127 и CTLA-4, которые обычно экспрессируются на повышенных уровнях в естественных Т-регуляторных клетках. Действительно, FoxP3 сохраняется в Т-регуляторных клетках, полученных из IPSC, даже после длительной стимуляции in vitro лигандом Notch, что обнаруживается при внутриклеточном окрашивании. Кроме того, эти антиген-специфичные IPSC Т-регуляторные клетки продуцируют супрессивные цитокины при стимуляции антигенными импульсными спленоцитами in vitro, что указывает на потенциальный супрессивный фенотип для этих клеток.

FoxP3-положительные клетки наблюдаются в коленях, обработанных OVA, при этом FoxP3-положительные клетки отсутствуют в коленях, которые получают IPSC, трансдуцируемые контрольным вектором. Кроме того, гораздо больше CD4-положительных, FoxP3-положительных, TCR3-бета-положительных клеток визуализируется в коленях мышей, получающих IPSC, трансдуцированные с помощью вектора TCR-FoxP3, чем только с помощью вектора FoxP3, что позволяет предположить, что антиген-специфические клетки IPSC-Treg мигрируют в антиген-индуцированное артритное колено после их адаптационного переноса животным-реципиентам. Адоптивный перенос клеток, полученный из IPSC, также влияет на существенное уменьшение воспалительного отека коленного сустава при наличии OVA, но не влияет на контрольные метилированные коленные суставы, введенные BSA.

Положительные эффекты уменьшения отека также подтверждаются микрокомпьютерной томографией с высоким разрешением, которая наблюдалась у коленных суставов, получавших лечение переносом клеток, по сравнению с контрольными животными, которым вводили только MBSA. После того, как эти углубленные процедуры будут собраны, они могут быть завершены за шесть недель, если они будут выполнены должным образом. При использовании этого метода важно помнить о необходимости индуцировать встроенную дифференцировку трансдуцированных антигена TCR-FoxP3 IPSC.

После этой процедуры также можно обсудить различные соединения подавляющих цитокинов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о выживаемости и качестве антиген-специфических клеток IPSCs T reg. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной терапии к изучению роли антиген-специфических регуляторных Т-клеток в аутоиммунных заболеваниях. Не забывайте, что работа с прямыми органами автокузова может быть чрезвычайно опасной, и что меры предосторожности, такие как работа в базовом двухместном учреждении, всегда должны приниматься во время выполнения процедуры.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.