Развитие стволовых клеток, полученных из антиген-специфических регуляторных Т-клеток против аутоиммунитета

Общая цель данного эксперимента заключается в разработке нового метода получения регуляторных Т-клеток, ассоциированных с воспаленным суставом и производных от стволовых клеток, для иммунотерапии аутоиммунного артрита. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области аутоиммунитета о потенциальных иммунотерапевтических средствах для лечения аутоиммунного артрита. Основным преимуществом данной методики является то, что регуляторные Т-клетки, производные от стволовых клеток, являются nyped и относятся к одному типу.

Начните с разведения интересующих фидерных клеток до минимальной плотности 1 × 10⁴ клеток на квадратный сантиметр в среде OP9, и высейте 1 × 10⁶ фидерных клеток в чашку диаметром 10 см. Когда клетки достигнут 80–90% конфлюэнтности, удалите среду из культур и высейте в каждую чашку от 0,5 до 1 × 10⁵ ретровирусно трансдуцированных индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в среде OP9. Через пять дней аспирируйте среду и промойте клетки 10 мл PBS.

Затем отделите клетки, добавив четыре миллилитра трипсина на каждую чашку при 37 °C. Через 10 минут остановите реакцию, добавив восемь миллилитров среды для IPSC, и перенесите клетки для центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах свежей среды для IPSC и перенесите клетки в новые чашки диаметром 10 см.

Дайте фидерным клеткам прикрепиться к планшету в течение 30 минут в инкубаторе для культур клеток. Затем соберите плавающие ИПСК и профильтруйте трансдуцированные клетки через сито с диаметром пор 70 мкм для подсчета. Высейте 5 × 10⁵ ИПСК на новый планшет с фидерными клетками (конфлюэнтность 80–90%) в среде OP9, дополненной Murine-Flt3-Ligand, и верните культуры в инкубатор.

Через три дня с помощью пипетки на 10 мл промойте чашку культуральной средой. Затем добавьте в чашку пять мл свежей среды OP9 и осторожно удалите полуадгезивные иПСК, аккуратно, но интенсивно прокачивая жидкость пипеткой, чтобы не повредить слой фидерных клеток. Повторите промывку 10 мл PBS для сбора оставшихся полуадгезивных клеток, собирая промывные жидкости из каждой чашки в одну коническую пробирку для каждой культуры.

После центрифугирования суспендируйте осадки клеток в 10 миллилитрах среды OP9, дополненной Murine-Flt3-Ligand и IL-7, и профильтруйте клетки через фильтр с размером пор 70 микрон. Посейте одну культуру IPSC в каждую лунку шестилуночного культурального планшета, содержащего монослои фидерных клеток с конфлюэнтностью 80–90%, и верните ко-культуры в инкубатор. Каждые два дня заменяйте половину среды на свежую среду OP9, дополненную Murine-Flt3-Ligand и IL-7, а каждые четыре-шесть дней по мере необходимости пересевайте дифференцирующиеся IPSC на новые планшеты со свежим слоем фидерных клеток.

Начните с отделения интересующих культур клеток с помощью трипсина и ресуспендирования каждого типа клеток в 10 миллилитрах свежей среды. Посейте каждую клеточную культуру в новую чашку диаметром 10 сантиметров и дайте фидерным клеткам прикрепиться в инкубаторе для клеточных культур. Через 30 минут соберите плавающие ИПСК и пропустите культуры через индивидуальные клеточные фильтры с размером пор 70 микрон, чтобы удалить клеточные кластеры перед подсчетом.

Ресуспендируйте каждую культуру в холодном PBS до концентрации 1,5 × 10⁷ клеток/мл, при необходимости повторно профильтруйте. Затем поместите самок мышей линии C57BL/6 в возрасте от четырех до шести недель по одной в фиксатор для мелких животных и выполните адаптивный перенос 200 µL одного типа клеток каждой мыши в хвостовую вену. С помощью штангенциркуля с циферблатом измерьте припухлость обоих коленных суставов для установления исходного значения.

Через 10 дней после переноса клеток с помощью одномиллилитрового шприца введите мышам 100 мкг метилированного BSA, эмульгированного в полном адъюванте Фройнда, в основание хвоста каждого экспериментального животного. Через 17 дней после переноса клеток индуцируйте артрит путем внутрисуставного введения 20 мкг метилированного BSA в 10 µL PBS в левый коленный сустав и 20 мкг метилированного BSA и 100 мкг цельного овальбумина в 10 µL PBS в правый коленный сустав каждого анестезированного животного, подвергнутого адаптивному переносу. Через семь дней после индуцирования артрита снова измерьте коленные суставы для расчета процента увеличения диаметра колена и хирургическим путем удалите надколенники.

Зафиксируйте суставы в формалине. Затем, после декальцинации в EDTA, залейте коленные суставы в парафин и получите срезы толщиной четыре микрона для гистохимического окрашивания и анализа. На 28-й день антигенспецифические T-регуляторные клетки экспрессируют значительные уровни CD3 и антигенспецифических T-клеточных рецепторов.

Большинство этих клеток также экспрессируют CD25, CD127 и CTLA-4, уровни которых обычно повышены в естественных регуляторных T-клетках. Действительно, FoxP3 сохраняется в регуляторных T-клетках, полученных из иПСК, даже после длительной стимуляции in vitro лигандом Notch, что было выявлено с помощью внутриклеточного окрашивания. Кроме того, эти антигенспецифические регуляторные T-клетки из иПСК вырабатывают супрессорные цитокины при стимуляции in vitro спленоцитами, пульсированными антигеном, что указывает на потенциальный супрессивный фенотип данных клеток.

В коленях, обработанных OVA, наблюдаются FoxP3-положительные клетки, в то время как в коленях, в которые были введены IPSC, трансдуцированные контрольным вектором, такие клетки отсутствуют. Кроме того, в коленях мышей, получивших IPSC, трансдуцированные вектором TCR-FoxP3, визуализируется значительно больше CD4-положительных, FoxP3-положительных и TCR3 Beta 5-положительных клеток, чем в группе с одним лишь вектором FoxP3. Это позволяет предположить, что антигенспецифичные IPSC-Treg клетки мигрируют в коленный сустав при антиген-индуцированном артрите после их адаптивного переноса реципиентам. Адаптивный перенос клеток, полученных из IPSC, также приводит к существенному уменьшению воспалительного отека коленного сустава при наличии OVA, но не оказывает влияния на колени, в которые была введена контрольная метилированная BSA.

Положительные эффекты снижения отека дополнительно подтверждаются микро-КТ снимками высокого разрешения, на которых наблюдается меньшая потеря костной ткани в коленях, подвергнутых трансплантации клеток, по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили только MBSA. При должном исполнении эти детальные процедуры могут быть завершены за шесть недель. При применении данного метода важно помнить о необходимости индуцировать направленную дифференцировку iPSC, трансдуцированных антигеном TCR-FoxP3.

После выполнения данной процедуры также можно рассмотреть использование различных соединений супрессорных цитокинов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о выживаемости и качестве антигенспецифических Treg-клеток, полученных из иПСК. После разработки этот метод открыл исследователям в области клеточной терапии путь к изучению роли антигенспецифических регуляторных Т-клеток при аутоиммунных заболеваниях. Не забывайте, что работа с непосредственными аутологичными бактериями может быть крайне опасной, и при выполнении процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в базовом боксе биологической безопасности.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в вашем эксперименте.