Высокоэффективная генерация антигена-специфических первичных мышей цитотоксических Т-клеток для функционального тестирования в модели аутоиммунного диабета

Этот протокол позволяет генерировать большое количество функциональных антиген-специфических Т-клеток, которые являются желаемым безопасным подходом в лечении аутоиммунных заболеваний. Основным преимуществом этой техники является то, что она обеспечивает вам высокоэффективный процесс трансдукции и большое количество функциональных Т-клеток. Этот метод может быть расширен для лечения диабета типа 1 и других аутоиммунных заболеваний, при которых известны антигены.

Кроме того, CAR Т-клеток может быть перспективным для лечения некоторых видов рака. Этот метод может быть использован для создания иммунных клеток, выражающих другие CARs. Важно иметь хорошую общепринятую технику, прочитать весь протокол и заранее спланировать весь эксперимент.

Этот двухнедельный протокол включает в себя мини-шаги, и успех зависит от правильной производительности каждого шага. Визуальные демонстрации этого метода имеют решающее значение для учащихся, чтобы следовать правильно. Подготовь клетки Феникса к трансфекции, как описано в рукописи.

Это хорошая практика, чтобы отметить боковую стену, где среда будет добавлена и удалена, чтобы свести к минимуму сдувающиеся клетки. В день ноль аспирировать супернатант из клеток и мыть их с пятью миллилитров PBS. Аккуратно добавьте семь миллилитров уменьшенной средней сыворотки в боковую стенку пластины и перенесите клетки обратно в инкубатор.

Добавьте 1,5 миллилитров уменьшенной среды сыворотки до двух 14-миллиметровых круглых полипропилевых трубок. Добавьте 40 микрометров трансфектного реагента в одну из трубок и 15 микрограммов антител, перенаправленных car plasmid вместе с пятью микрограммами упаковочной плазмиды в другую. Инкубировать трубки при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем добавить реагент трансфекции в плазмидную трубку.

Смешайте, аккуратно трубя раствор вверх и вниз три раза и инкубировать его при комнатной температуре, по крайней мере 20 минут. Добавьте три миллилитров смеси в клетки Феникса и поместите их в инкубатор культуры тканей. Через четыре-пять часов добавить один миллилитр FCS в клетки и культуры их на ночь при 37 градусов по Цельсию.

На следующий день удалите супернатант из клеток и добавьте четыре миллилитров свежей довоенной культуры среды. Урожай вируса на второй день, собирая вирус, содержащий средние из клеток Феникса и фильтрации его для удаления остаточного мусора клеток. Добавьте рекомбинантный запас человека Ил-2 к вирусу для окончательной концентрации 200 международных единиц на миллилитр и немедленно используйте его для трансдукции.

Добавьте четыре миллилитров свежей среды в клетки Феникса и поместите их в инкубатор на ночь. Повторите сбор вируса на следующий день для второй трансдукции и выбросить клетки. За день до посева murine CD8 Т-клеток, добавить один миллилитр смеси анти-мышь CD3 и CD28 антител к каждому хорошо из 24 хорошо пластины и инкубировать пластины на ночь на четыре градуса по Цельсию.

На нулевой день, урожай мыши селезенки и положить их на клетку ситечко замачивания в 10 миллилитров PBS в клеточной культуры блюдо на льду. В капюшоне клеточной культуры разрежьте каждую селезенку на три-пять частей и используйте стерильный поршень шприца, чтобы нажать на ткань через проволочную сетку. Аккуратно удалите красные кровяные тельца путем повторного перерасхода спеноцитов в одном-четырех разбавленных красных клеток лиза буфера и инкубации их при комнатной температуре в течение пяти минут, а затем разбавить 10 микролитров клеточной подвески с Trypan Blue для подсчета клеток.

И гранулы остальные клетки центрифугирования на 350 раз г в течение семи минут. Используйте набор изоляции клеток CD8 T для обогащения клеток CD8 T и приостанавливайте клеточные гранулы в 400 микролитров буфера со 100 микролитров биотинового антитела коктейль в один раз от 10 до восьмой клетки. Смешайте клеточной суспензии хорошо и инкубировать его в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы антитела связывания.

Затем добавьте 300 микролитров буфера маркировки и 200 микролитров анти-биотиновых микробусов на 10 восьмых клеток. Хорошо перемешать и инкубировать еще 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Между тем, установите разделительную колонку на сепараторе и помойте ее тремя миллилитровами буфера маркировки.

Положите 40-метровый клеточный ситечко на верхнюю часть столбца и перейдите один миллилитр шарика и клеточной смеси через ситечко в разделительную колонку. Соберите поток через в prechilled 15 миллилитров трубки и мыть колонку в соответствии с указаниями производителя, собирая сточные воды в той же трубе. Подсчитайте клетки и соберите их центрифугой в 350 раз г в течение пяти минут.

Вымойте их двумя миллилитров Т-клеток среды и центрифуги снова. Затем повторное их в довоенной среде Т-клеток в концентрации от 250 000 до 500 000 клеток на миллилитр. Вымойте ранее подготовленные CD3 и CD28 антитела покрыты пластины с одним миллилитр стерильных PBS три раза и добавить два миллилитров клеточной подвески к каждому хорошо.

Используйте закрученное движение, чтобы равномерно распределить клетки. В качестве контроля, пластины такое же количество CD8 Т-клеток в одном не покрытием хорошо пластины и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в 10%углекислого газа газового баллона инкубатор в течение 48 часов. В первый день подготовьте фрагмент фибронектина с покрытием пластин, добавив 0,5 миллилитров фибронектина в колодцы 24-хорошо пластины и инкубации его в течение ночи при четырех градусах по Цельсию.

На следующий день удалите раствор фибронектина и добавьте один миллилитр 2%BSA и PBS на колодец. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут и мыть обработанные колодцы с одним миллилитром стерильных PBS. Пластина готова к использованию после удаления раствора для мытья.

Подсчитайте активированные Т-клетки CD8 с помощью Trypan Blue. Соберите их по центрифугации. И повторно использовать их на пять миллионов жизнеспособных клеток на миллилитр для трансдукции.

Добавьте 100 микролитров активированной клеточной подвески CD8 к каждому колодец фибронектиновой пластины. Затем добавьте от 1,5 до двух миллилитров ранее подготовленного вируса, содержащего средний и смешайте с помощью закрученного движения, чтобы равномерно распределить клетки. Запечатай тарелку в мешке Циплок и центрифуга при 2000 раз г в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия.

Снимите пластину с центрифуги и отвелите ее в кабинет биологической безопасности. Аккуратно удалите полиэтиленовый пакет и убедитесь, что снаружи пластины не загрязнены средой. Перенесите пластину в инкубатор двуокиси углерода 37 градусов по Цельсию.

Через четыре часа снимите по миллилитр среды из каждой хорошо, замените его на один миллилитр предварительно заранее затяжевой полной Т-клеточной среды и положите пластину обратно в инкубатор. Важнейшими аспектами этого протокола являются вирус высокого titer, здоровые активированные Т-клетки, и соответствующий метод трансдукции. Клетки были совместно окрашены с PE размер семь спряженных анти-CD8, AF647 спряженных анти-CD3, и BV 421 конъюгированных анти-CD28 для цитометрического анализа потока.

Приблизительно 70% Т-клеток CD8 совместно выразили GFP, что указывает на выражение ЦАР. Они также совместно выразили CD28 и CD3. Важно отметить, что все тест GFP положительные клетки также совместно окрашенных с I-Ag7 инсулина BR3 тетрамеры, которые указывают на выражение ЦАР на поверхности клетки, но не с тетрамером управления.

Кроме того, отсортированный тест и контроль CAR Т-клеток каждый выделяется высокий уровень интерферона гамма только после совместной культуры с целевыми клетками, выражают свои лиганды cognate, который подтверждает, что транс индуцированные клетки имеют CD8 эффектор Т-клеток фенотип направлен на цель родительских антител. Наиболее важными шагами этого эксперимента являются трансдукция клеток производителя вируса, изоляция первичных клеток CD8 T и активация этих Т-клеток. Наличие здоровых активированных Т-клеток и трансдукция этих Т-клеток с соответствующими реагентами обеспечивает благоприятные результаты.

Этот метод может быть использован для трансдуцирования других Т-клеток, но он должен быть настроен для конкретного типа Т-клеток. Этот протокол прокладывает путь для профилактики диабета типа 1 с антиген-специфическим химерным рецептором антигена Т-клеточной терапии.