Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Генерация Т-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS) дает альтернативный подход к использованию эмбриональных стволовых клеток для иммунотерапии на основе Т-клеток. Метод показывает, что при использовании системы индукции in vitro или in vivo iPS-клетки способны дифференцироваться как в обычные, так и в антиген-специфические Т-лимфоциты.

Общей целью этой процедуры является получение и характеристика Т-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или клеток IPS. Затем IPS-клетки могут быть дифференцированы in vitro на системе OP nine DL one culture, а затем созрели in vivo на мышах с дефицитом тряпки. Или клетки могут быть генетически модифицированы для сверхэкспрессии OT One TCR, а затем адоптивно перенесены для разработки in vivo.

После шести недель дифференцировки in vivo мышам можно ввести внутрибрюшинную инъекцию семи опухолевых клеток ЭЭГ, а затем оценить антигенную специфичность Т-клеток, полученных из IPS. В конечном счете, IPS-клетки могут дифференцироваться как в обычные, так и в антиген-специфические Т-клетки, последние из которых способны защищать животных от опухолевого поражения. Применение этого метода распространяется на индивидуализированную иммунотерапию рака.

Метод позволяет генерировать большое количество опухолевых реактивных Т-клеток, полученных из минимального количества крови или кожной ткани пациента В нулевой день перенесите пять раз по 10 на четвертую IPS-клетки на 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую сливающийся OP 9, DL одноклеточный монослой в 20%FBS альфа-среде MEM на пятый день. Трипсиновые глаза. Затем центрифугируйте клетки после их инкубации на свежей 100-миллиметровой чашке для культуры в течение 30 минут и 37-градусной инкубационной тарелке, пять раз по 10 до пятой части плавающих клеток в 20% FBS альфа, MEM среде и мышиной плоской трехлигандной среде на новой 100-миллиметровой чашке, содержащей монослой OP 9. DL 1 клетки на восьмой день аккуратно пипетируют вниз по слабо прикрепленным клеткам, центрифугируют клетки, а затем переносят клетки в одну лунку из шести лунок, покрытую сливающимся OP 9 DL one клетки инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа в течение еще двух недель на 22-й день.

Инкубируйте отделенные клетки IPS в свежей среде на новой чашке для культивирования при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем удалите около половины плавающих клеток и пропустите их через нейлоновое ситечко толщиной 70 микрон, чтобы исключить комки клеток, и трижды промойте полученную одноклеточную суспензию холодной PBS. После третьего промывания повторно суспендируйте клетки в PBS в 1,5 раза по 10-й седьмой части на миллилитр и поддерживайте клетки на льду перед внутривенным введением.

Поместите четырехнедельную мышь с дефицитом тряпки под инфракрасный свет, чтобы расширить хвостовую вену. Затем наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 с половиной калибра, 200 микролитрами клеточной суспензии и адоптивно перенесите клетки через расширенную хвостовую вену. Через три недели после подтверждения эвтаназии усыновленной мыши удалите лимфатические узлы и селезенку после механического разрушения тканей.

Лизируют суспензию одиночных клеток с помощью буфера для лизиса CK, а затем дважды промывают полученные мононуклеоциты в холодном PBS. Затем, после окрашивания на маркеры клеточной поверхности, оценить клетки с помощью проточного цитометрического анализа в нулевой день, использовать реагент для трансфекции гена JAMA для трансфекции клеток упаковки с ночным покрытием пластины E с помощью OT One MIDR в первый день посева один раз по 10 до шести клеток IPS в одну лунку с 0,1% желатиновым предварительно закодированным 24-луночным планшетом на второй день. собрать псевдовирус, содержащий Snatin, из клеток plat E, а затем пропустить его через фильтр размером 0,4 микрона, чтобы исключить потенциальные загрязнения после центрифуги. Трансдукция клеток в присутствии полимозга в течение одного часа при 330 G при 32 градусах Цельсия.

Инкубируйте их в течение ночи при той же температуре после повторения процедуры трансдукции. Трипсин просматривает трансдуцированные IPS-клетки на четвертый день, а затем после гранулирования клетки суспендируют клетки в свежей среде и засеивают их на предварительно закодированные облученные snl 7 6 7 фидерные клетки. После того, как трансдуцированные клетки достигнут беглости, отсортируйте красные двойные положительные клетки GFP и DS с помощью проточной цитометрии.

Через шесть недель после адоптивного переноса клеток IPS ввели 50 микролитров ЭЭГ семи клеток ЭЭГ в брюшную полость той же мыши на 50-й день после опухолевого заражения. Используйте набор для выделения восьми положительных Т-клеток mil E biotech CD для сортировки восьми положительных Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов адоптивно перенесенного животного. Смешайте выделенные CD восемь положительных Т-клеток с облученным размером SPOC от наивной мыши C 57 black six J в соотношении один к 10 и пульсируйте ко-культуру 0,5 микромолями на миль яйцеклеток в течение 40 часов.

После этого добавьте в ячейки фельден А еще на четыре часа. Наконец, оцените клеточные популяции с помощью проточного цитометрического анализа После выделения SP-цитов у наивной мыши C 57 black six J. Разделите клеточную суспензию на две группы.

Пометьте высокую группу CFSE пятью микромолями на милль CFSE и пульсируйте клетки 10 микрограммами на мил пептида яйцеклеток в течение одного часа, помеченные низкой группой A-C-F-S-E 0,5 микромолями на милл CFSE и не пульсируйте. Смешайте 2,5 раза по 10 до шестой, высокие ячейки CFSE с 2,5 умножить на 10 до шестой, низкие ячейки CFSE в PBS. Затем анализируют циты с помощью проточной цитометрии на экспрессию CFSE.

Через 16 часов после адоптивного переноса на интересующую мышь: Подсчитать внутрибрюшинные опухолевые клетки на 20-й день после заражения опухолью. Используйте шприц объемом 10 миллилитров, оснащенный иглой 18 с половиной калибра и холодным PBS, для промывания брюшинной полости. Подсчитайте восстановленные опухолевые клетки для идентификации инфильтрирующих опухоль клеток.

Удалите опухоль на поздней стадии опухолевого поражения, а затем разрежьте опухоль на три части. Поместите первую часть опухоли в криопробирку и положите флакон на сухой лед. Сразу же закрепляем второй кусок формальдегида.

Третью деталь храните в кондиционированном среде RPMI 1640 после сушки на воздухе криоконсервированных участков ткани. Зафиксируйте их в холодном ацетоне на 15 минут, после сушки на воздухе неподвижных участков еще 15 минут. После стирки вымойте слайды в течение пяти минут в PBS.

Поместите предметные стекла во влажную камеру и накройте срезы ткани 30 микролитрами 3% B, SA и PBS на 30 минут, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Затем промокните блокирующий буфер и инкубируйте участки ткани смесью 50 микролитров антитела pe anti TCR RV alpha two и антитела fitzy anti ova, разведенного в 3% PSA в PBS во влажной камере в течение двух часов в конце инкубации. Трижды промыть предметные стекла в холодной ПБС, окончательно смонтировать срезы монтажным материалом на водной основе перед флуоресцентным микроскопическим исследованием для проточного цитометрического анализа инфильтрирующих опухоль Т-клеток.

Раздавите опухоль в одноклеточную суспензию. Затем проанализируйте ячейки на наличие конкретных поверхностных маркеров. C CD 3 и TCR beta используются в качестве маркеров Т-клеток для определения того, может ли стимуляция клеток IPS с помощью лиганда notch DL one способствовать экспрессии поверхности CD 4 и CD 8 клеток CD на трех положительных TCR r бета-положительных клетках, полученных из IPS-клеток.

Обратите внимание на точечную диаграмму справа, которая показывает день 22 CD, три положительных TCR R, бета-положительный CD, четыре отрицательных CD, восемь положительных одиночных положительных Т-клеток, полученных из IPS-клеток in vitro. Кроме того, одиночные положительные клетки, полученные из IPS-клеток из предыдущего рисунка, продуцировали интерлейкин-2 и интерферон гамма при стимуляции in vitro покрытыми пластинами анти-CD-3 и растворимыми анти-CD-28 антителами, подтверждающими, что Т-клетки, полученные из IPS-клеток, функциональны после адоптивного переноса мышам-реципиентам. Большинство трансдуцированных IPS-клеток гена TCR подвергались дифференцировке в CD восемь положительных CTL, которые in vitro реагировали на пептидную стимуляцию путем секреции интерлейкина 2 и интерферона гамма на этих точечных графиках из объединенных клеток лимфатических узлов и селезенки.

У мышей, которым адоптивно перенесли трансдуцированные TCR-трансдуцированные, но не контролируемые трансдуцированные IPS-клетки, были получены CD восемь положительных V-бета и пять положительных Т-клеток. Позитивные популяции CD 8 с положительным V-бета-5 были положительными на внутриклеточное окрашивание цитокинов на интерлейкин-2 и продукцию интерферона гамма, представленную на этих гистограммах темными линиями, по сравнению с затененными контрольными гистограммами изотипа, указывающими на то, что CTL, полученные из IPS, были функциональными. Эти данные показывают, что клетки с высоким уровнем CFSE пульсировали эптидом, представленным пиками справа на каждом графике, и контрольными клетками с низким уровнем CFSE, представленными пиками слева, которые были введены мышам через 10 недель после переноса клеток IPS или через один день после переноса O OT одного CTL.

CTL, полученные из антиген-специфических IPS, реагировали на антигенную стимуляцию и обладали цитотоксической активностью, на что указывает отсутствие клеток с высоким уровнем CFSE здесь. Трансдуцированные IPS-клетки с одним геном OT TCR были адоптивно перенесены в черные шесть мышей C 57, а затем мышей подвергли воздействию ЭЭГ семи опухолевых клеток на 20-й день, опухолевые клетки в брюшной полости. Обратите внимание на значительное снижение количества опухолевых клеток у мышей, получавших TCR TRANSDUCED IPS по сравнению с контрольными группами.

Наиболее важным является то, что адоптивный перенос TCR TRANSDUCED IPS клеток вызывал инфильтрацию сверхреактивных CTL в опухолевые ткани и защищал животных от опухолевого воздействия, как видно на этом h и e окрашивании опухолевых тканей, восстановленных через 30-35 дней после опухолевых провокационных опухолей от мышей, адоптивно перенесенных с помощью TCR-трансдуцированных клеток или OT 1 CTL, но не имитационных инъекций или контрольных клеток. Трансдуцированные клетки инфильтрировались воспалительными клетками, на что указывают красные стрелки. Было обнаружено, что специфичные для яйцеклеток V альфа два положительных CTL красного цвета проникают в яйцеклетки, экспрессирующие опухолевые ткани зеленого цвета.

В то время как опухоли у мышей из контрольных групп имели меньше или вообще не имели инфильтрирующих опухоль клеток на этом рисунке, суспензии одиночных клеток из опухолевых тканей были проанализированы на экспрессию положительного результата V альфа 2 и положительного V бета 5 с помощью проточной цитометрии после гейтирования на CD 8 положительной популяции. Следует отметить, что опухолевые ткани мышей, которым адоптивно перевезли клетки TCR Transduced IPS, показали самый высокий уровень инфильтрирующих опухоль клеток, в то время как опухоли мышей, получивших контроль. Трансдуцированный IPS не проявлял инфильтрации специфичными для яйцеклеток CD восемью положительными Т-клетками.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генерировать антиген-специфические Т-клетки из клеток IPS и как оценить функции Т-клеток, полученных из IPS.