Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Общая цель данной процедуры заключается в получении и характеристике Т-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). ИПСК могут быть дифференцированы in vitro в системе культивирования OP9 DL1 с последующим созреванием in vivo в мышах с дефицитом Rag. Также клетки могут быть генетически модифицированы для гиперэкспрессии TCR OT-1 с последующим адаптивным переносом для развития in vivo.

После шести недель дифференцировки in vivo мышам могут быть введены опухолевые клетки EEG семь путем внутрибрюшинной инъекции, после чего можно оценить антигенную специфичность Т-клеток, полученных из иПСК. В конечном итоге иПСК могут дифференцироваться как в конвенциональные, так и в антигенспецифические Т-клетки, причем последние способны защищать животных от опухолевого воздействия. Значение данного метода заключается в возможности развития индивидуализированной иммунотерапии рака.

Данный метод позволяет генерировать большое количество опухоле-реактивных Т-клеток, полученных из минимального объема крови или ткани кожи пациента. В день 0 перенесите 5×10⁴ ИПСК на культуральную чашку диаметром 100 мм, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9-DL1 в среде alpha-MEM с 20% FBS. На пятый день проведите трипсинизацию. Затем центрифугируйте клетки после инкубации в новом 100-миллиметровом культуральном диске в течение 30 минут в инкубаторе при 37°C. Высейте 5×10⁵ суспензионных клеток в среде alpha-MEM с 20% FBS и лигандом mouse FLT3 на новую чашку диаметром 100 мм, содержащую монослой клеток OP9-DL1. На восьмой день аккуратно соберите с помощью пипетки слабо прикрепленные клетки, центрифугируйте их и перенесите в одну лунку 6-луночного культурального планшета, покрытого конфлюэнтными клетками OP9-DL1. Инкубируйте клетки при 37°C и 5% CO₂ еще в течение двух недель. В день 22.

Инкубируйте отделенные клетки IPS в свежей среде в новой культуральной чашке при 37 °C в течение 30 минут. Затем удалите около половины плавающих клеток и пропустите их через нейлоновый фильтр с размером пор 70 мкм для удаления клеточных агрегатов, после чего трижды промойте полученную суспензию одиночных клеток холодным PBS. После третьей промывки ресуспендируйте клетки в PBS до концентрации 1,5 × 10⁷ клеток/мл и храните их на льду до момента внутривенного введения.

Поместите четырехнедельную мышь с дефицитом rag под инфракрасную лампу для расширения хвостовой вены. Затем наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой калибра 26,5, 200 µL клеточной суспензии и проведите адаптивный перенос клеток через расширенную хвостовую вену. Спустя три недели, после подтверждения эвтаназии мыши с перенесенными клетками, удалите лимфатические узлы и селезенку после механического измельчения тканей.

Лизируйте суспензию из единичных клеток с использованием буфера для лизиса CK, затем дважды промойте полученные мононуклеары холодным PBS. После окрашивания на маркеры клеточной поверхности проведите анализ клеток методом проточной цитометрии в нулевой день. В первый день используйте реагент для трансфекции генов JAMA для ночной трансфекции посеянных упаковочных клеток Plat-E с использованием OT-1 MIDR. Во второй день посейте 1×10⁶ iPS-клеток в одну лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 0,1% желатином. Соберите содержащий псевдовирус супернатант из клеток Plat-E, затем пропустите его через фильтр с порами 0,4 мкм для удаления возможных загрязнителей после центрифугирования. Проведите трансдукцию клеток в присутствии полибрена в течение одного часа при 330×g и температуре 32 °C.

Инкубируйте их в течение ночи при той же температуре после повторения процедуры трансдукции. На четвертый день обработайте трансдуцированные ИПС-клетки трипсином, затем после центрифугирования и осаждения клеток ресуспендируйте их в свежей среде и высейте на предварительно кодированные облученные фидерные клетки snl 7 6 7. После того как трансдуцированные клетки достигнут конфлюэнтности, выделите двойные положительные клетки (GFP и DS red) методом проточной цитометрии.

Через шесть недель после адаптивного переноса клеток IPS, на 50-й день после введения опухоли, введите 50 µL клеток EEG seven thoma в брюшную полость той же мыши. Используйте набор для изоляции CD8+ T-клеток Miltenyi Biotec для выделения CD8+ T-клеток из селезенки и лимфатических узлов животного, которому был произведен адаптивный перенос. Смешайте выделенные CD8+ T-клетки с облученными клетками SPOC из наивной мыши C57BL/6J в соотношении 1:10 и проведите пульсацию совместной культуры 0.5 µM ova в течение 40 часов.

После этого добавьте felden A к клеткам еще на четыре часа. В завершение оцените популяции клеток с помощью проточной цитометрии. После выделения SP-клеток из наивной мыши линии C 57 black six J разделите клеточную суспензию на две группы.

Пометьте группу с высоким содержанием CFSE, используя 5 µM CFSE, и проведите пульс-стимуляцию клеток овальным пептидом в концентрации 10 µg/mL в течение одного часа; группу с низким содержанием CFSE пометьте 0,5 µM CFSE и не подвергайте пульс-стимуляции. Смешайте 2,5 × 10⁶ клеток с высоким содержанием CFSE и 2,5 × 10⁶ клеток с низким содержанием CFSE в PBS. Затем проанализируйте клетки методом проточной цитометрии на экспрессию CFSE.

Через 16 часов после адаптивного переноса в исследуемую мышь. Для подсчета интраперитонеальных опухолевых клеток на 20-й день после введения опухоли используйте шприц объемом 10 мл, оснащенный иглой калибра 18,5, и холодный PBS для промывания брюшной полости. Подсчитайте извлеченные опухолевые клетки для идентификации опухоль-инфильтрирующих клеток.

Удалите опухоль на поздней стадии развития и разделите её на три части. Поместите первый фрагмент опухоли в криопробирку и установите пробирку на сухой лед. Второй фрагмент немедленно зафиксируйте формальдегидом.

Поместите третий образец в кондиционированную среду RPMI 1640 после высушивания криоконсервированных срезов ткани на воздухе. Зафиксируйте их в холодном ацетоне в течение 15 минут, предварительно высушив фиксированные срезы на воздухе еще в течение 15 минут. После этого промойте предметные стекла в PBS в течение пяти минут.

Поместите предметные стекла во влажную камеру и нанесите на срезы тканей 30 µL 3%B, SA и PBS на 30 минут для блокирования неспецифического связывания. Затем удалите блокирующий буфер с помощью фильтровальной бумаги и инкубируйте срезы тканей во влажной камере в течение двух часов с использованием 50 µL смеси антител pe anti TCR RV alpha two и fitzy anti ova, разведенных в 3%PSA в PBS. По окончании инкубации трижды промойте стекла холодным PBS, после чего закройте срезы водным средством для заключения перед исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии для проточного цитометрического анализа опухоль-инфильтрирующих Т-клеток.

Разотрите опухоль до получения суспензии одиночных клеток. Затем проанализируйте клетки на наличие специфических поверхностных маркеров. Для идентификации T-клеток использовались маркеры CD3 и TCR beta, чтобы определить, может ли стимуляция IPS-клеток лигандом notch DL1 способствовать экспрессии CD4 и CD8 на поверхности T-клеток; оценивалась экспрессия CD4 и CD8 на поверхности CD3-положительных TCR beta-положительных клеток, производных от IPS-клеток.

Обратите внимание на точечную диаграмму справа, на которой показаны одиночно положительные Т-клетки (CD3+, TCRβ+, CD4- CD8+), полученные из ИПСК in vitro на 22-й день. Кроме того, одиночно положительные клетки, производные от ИПСК, показанные на предыдущем рисунке, вырабатывали интерлейкин-2 и интерферон-гамма при стимуляции in vitro антителами к CD3, нанесенными на планшет, и растворимыми антителами к CD28, что подтверждает функциональность Т-клеток, полученных из ИПСК, после адаптивного переноса в мышей-реципиентов. Большинство ИПСК, трансдуцированных геном TCR, дифференцировались в CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты, которые реагировали in vitro на пептидную стимуляцию секрецией интерлейкина-2 и интерферона-гамма, что видно на данных точечных диаграммах клеток, собранных из лимфатических узлов и селезенки.

Т-клетки CD8+ Vβ5+ были получены у мышей, которым были адаптивно перенесены трансдуцированные TCR, но не контрольные трансдуцированные иПСК. Популяции CD8+ Vβ5+ были положительными при внутриклеточном цитокиновом окрашивании на продукцию интерлейкина 2 и интерферона гамма, что на данных гистограммах представлено темными линиями по сравнению с затененными гистограммами изотипического контроля, что указывает на функциональность CTL, полученных из иПСК. Эти данные показывают, что клетки с высоким содержанием CFSE, пульсированные эпитопом, представлены пиками справа на каждом графике, а контрольные клетки с низким содержанием CFSE представлены пиками слева; данные клетки вводились мышам через 10 недель после переноса иПСК или через один день после переноса OT-I CTL.

антигенспецифические CTL, полученные из IPS, ответили на стимуляцию антигеном и проявили цитотоксическую активность, на что указывает отсутствие здесь клеток с высоким содержанием CFSE. IPS-клетки, трансдуцированные одним геном TCR, были перенесены методом адоптивного переноса мышам C 57 black six, после чего мышам проводили воздействие опухолевых клеток EEG seven; на 20-й день подсчитывали количество опухолевых клеток в брюшной полости. Обратите внимание на значительное снижение количества опухолевых клеток у мышей, получивших трансдуцированные TCR IPS, по сравнению с контрольными группами.

Что наиболее важно, адаптивный перенос TCR-трансдуцированных ИПС-клеток вызвал инфильтрацию гиперответных ЦТЛ в опухолевые ткани и защитил животных от опухолевого вызова, что видно на данном окрашивании тканей опухоли гематоксилином и эозином, полученных через 30–35 дней после опухолевого вызова; опухоли наблюдались у мышей, которым были адаптивно перенесены TCR-трансдуцированные клетки или OT-I ЦТЛ, но не у мышей с имитационной инъекцией или в контрольной группе. Трансдуцированные клетки были инфильтрированы воспалительными клетками, на что указывают красные стрелки. Было обнаружено, что Ova-специфические Vα2-положительные ЦТЛ (красным цветом) инфильтрируют экспрессирующие Ova опухолевые ткани (зеленым цветом).

В то время как в опухолях мышей из контрольных групп на данном рисунке наблюдалось меньше инфильтрирующих опухоль клеток или их полное отсутствие, суспензии одиночных клеток из тканей опухоли были проанализированы методом проточной цитометрии на экспрессию V alpha two и V beta five после гейтирования по популяции CD eight положительных клеток. Обратите внимание, что ткани опухолей мышей, которым были адаптивно перенесены TCR-трансдуцированные IPS-клетки, демонстрировали самый высокий уровень инфильтрации опухоли, тогда как в опухолях мышей, получавших контрольные трансдуцированные IPS-клетки, инфильтрация ova-специфичными CD eight положительными T-клетками отсутствовала.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как генерировать антигенспецифичные T-клетки из иПСК-клеток и как оценивать функции T-клеток, полученных из иПСК.