Инъекционный метод Альтернативный и Validated для доступа субретинальной пространства

Общая цель данного исследования — описать новый метод субретинальной инъекции, который может быть использован для введения вирусных векторов, фармакологических агентов или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в субретинальное пространство у мышей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области исследования зрения и офтальмологии, такие как оценка эффективности новых терапевтических вмешательств при дегенерациях сетчатки. Основным преимуществом данной методики является возможность высокоэффективной доставки материала в субретинальное пространство с минимальным повреждением и быстрым восстановлением структуры и функций сетчатки.

Процедуру продемонстрирует Сачин П., техник моей лаборатории. Для начала процедуры подстригите вибриссы анестезированной мыши для облегчения визуализации и поддерживайте температуру тела животного на уровне 37 °C с помощью циркуляционной водяной подушки. Затем расширьте зрачки, используя 2,5% капли для глаз с фенилэфрином.

Затем закапайте в глаза капли с метилцеллюлозой для предотвращения пересыхания и минимизации риска развития транзиторной катаракты, вызванной анестезией. Стерилизуйте инструменты перед операцией. После этого приготовьте раствор флуоресцеина в шкафу биологической безопасности.

Заполните шприц соответствующим количеством флуоресцеина. Затем проведите щипковый тест пальца ноги, чтобы убедиться, что животное находится в состоянии глубокой анестезии, и расположите мышь так, чтобы глаз, в который будет вводиться препарат, был обращен вверх и четко виден под диссекционным микроскопом. Осторожно зажмите височную конъюнктиву тонкоконечным пинцетом.

Затем с помощью изогнутых ножниц Vannas сделайте циркулярный разрез примерно на 90 градусов. Повторите процедуру на лежащей под ним капсуле Тенона. После этого удалите окружающую соединительную ткань с помощью пинцета с тонкими концами, вращая глазное яблоко в сторону носа.

Работайте в области места инъекции, примерно в 0.5 миллиметрах от зрительного нерва, соблюдая крайнюю осторожность, чтобы не повредить ретроорбитальный синус. Критическим этапом является обнажение места инъекции, что требует поворота глаза без повреждения самого глаза или связанных с ним структур, особенно избегая повреждения орбитального кровенаполненного синуса. В ходе данной процедуры сделайте небольшой разрез склеры в месте инъекции, осторожно процарапав глазное яблоко офтальмологическим лезвием под углом 22.5 градуса.

Этот разрез должен быть достаточно большим только для того, чтобы через склеру мог пройти кончик иглы. Затем введите кососрезанную иглу калибра 33g в отверстие склеротомии так, чтобы срез был направлен параллельно сетчатке. Введите необходимое количество 0,01% флуоресцеина, медленно и с равномерным усилием нажимая на plunger.

Обратите внимание, что при нахождении иглы в субретинальном пространстве при нажатии на plunger будет ощущаться легкое сопротивление. Сопротивление будет отсутствовать, если игла проколет сетчатку, и будет высоким, если игла не penetrated склеру или RPE. Еще одним критическим этапом является введение препарата точно в субретинальное пространство.

Это необходимо выполнить, не проколов нейросенсорную сетчатку насквозь до стекловидного тела. Перед извлечением иглы подождите несколько секунд, чтобы минимизировать обратный ток. Затем промойте глаз стерильным физиологическим раствором и убедитесь, что глаз вернулся в нормальное положение.

Затем нанесите толстый слой тройного антибиотика в форме офтальмической мази на поверхность роговицы инъецированного глаза. После этого поместите мышь в чистую индивидуальную клетку для восстановления. Следите за дыханием и температурой животного во время выхода из наркоза и убедитесь, что оно способно поддерживать положение лежа на животе.

Проведите дополнительный соответствующий послеоперационный мониторинг и лечение, включая подкожную инъекцию карпрофена для купирования послеоперационного болевого синдрома. Ниже представлена 3D-реконструкция куполообразной пузырчатой отслойки в месте инъекции. Область куполообразной пузырчатой отслойки затем заполнена плотным белым цветом, чтобы показать степень и границы отслойки сетчатки.

Поперечные срезы сетчатки на ОКТ видны в белом цвете, в то время как заполненное жидкостью пространство на уровне РПЭ и фоторецепторов выглядит черным. На данном рисунке представлены репрезентативные сканы OCTB в области максимальной отслойки сетчатки до инъекции, через 10 минут после инъекции и через четыре недели после инъекции. На этом изображении показано формирование и рассасывание плоской пузырчатой отслойки после введения 0.3 µL препарата.

На этом изображении показаны формирование и рассасывание куполообразного пузыря после инъекции 0.5 µL, в то время как на данном изображении представлены формирование и рассасывание куполообразного пузыря после инъекции 1 µL. Наконец, здесь приведён пример выраженного рубцевания хориоидеи и истончения сетчатки в месте инъекции. Сетчатки сохраняют нормальную функцию после рассасывания пузыря.

При девяти интенсивностях освещения представлены формы волны скотопических ответов, опосредованных палочками, до инъекции и через четыре недели после инъекций объемом 0,3 мкл, 0,5 мкл и 1 мкл. После освоения данной методики процедура может быть выполнена за 10–15 минут для одного глаза. При выполнении данной процедуры важно оценить состояние глаз перед началом работы.

Исключите глаза с помутнениями роговицы или хрусталика, а также глаза с глубокой посадкой, при которых выполнение данной процедуры будет крайне затруднительным. После проведения этой процедуры можно применить другие методы, такие как ОКТ и визуализация глазного дна, для оценки качества инъекции.