Инъекционный метод Альтернативный и Validated для доступа субретинальной пространства с помощью Подход склеру Задней

Общая цель данного исследования состоит в том, чтобы описать новую технику субретинальной инъекции, которая может быть использована для нацеливания на вирусные векторы, фармакологические агенты или индуцирования плюрипотентных стволовых клеток в субретинальное пространство у мышей. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области науки о зрении и офтальмологии, такие как оценка эффективности новых терапевтических вмешательств при дегенерации сетчатки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно доставлять материал в субретинальное пространство с высокой эффективностью, минимальным повреждением и быстрым восстановлением структуры и функции сетчатки.

Демонстрировать процедуру будет Сачин., техник из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, подрежьте усы мыши, находящейся под наркозом, чтобы облегчить визуализацию, и поддерживайте температуру тела животного на уровне 37 градусов по Цельсию с помощью циркуляционной водяной прокладки. Затем расширьте его зрачки с помощью глазных капель с 2,5% фенилэфрином.

Затем нанесите глазные капли метилцеллюлозы, чтобы предотвратить сухость и свести к минимуму транзиторную катаракту, вызванную анестезией. Стерилизуйте инструменты перед операцией. После этого приготовьте разведенный флуоресцеин в шкафу биобезопасности.

Наполните шприц соответствующим количеством флуоресцеина. Затем выполните щипнение пальцев ног, чтобы убедиться, что животное глубоко обезболито, и расположите мышь так, чтобы глаз, которому нужно сделать инъекцию, был обращен вверх и хорошо виден в препарирующий микроскоп. Аккуратно зажмите височную конъюнктиву парой щипцов с тонким наконечником.

Затем сделайте круговой разрез примерно на 90 градусов с помощью изогнутых ножниц Ванны. Повторите процедуру на нижележащей капсуле Тенона. После этого исследуйте окружающий соединительный вопрос с помощью щипцов с тонким наконечником, вращая при этом глазок носом.

Работайте по направлению к месту инъекции на расстоянии примерно 0,5 миллиметра от зрительного нерва и будьте очень осторожны, чтобы не нарушить ретроорбитальный синус. Критическим этапом является обнажение места инъекции, что требует вращения глаза, не повреждая сам глаз или связанные с ним структуры, в частности, избегая повреждения орбитального кровеносного мешка. При этой процедуре сделайте небольшой разрез на склере в месте инъекции, аккуратно поцарапав наглазник офтальмологическим лезвием под углом 22,5 градуса.

Этот разрез должен быть достаточно большим, чтобы кончик иглы мог пройти через склеру. Затем вставьте скошенную иглу 33 калибра в склеротомию скошенной стороной и под углом параллельно сетчатке. Введите желаемое количество 0,01% флуоресцеина, медленно нажимая на поршень с равномерным давлением.

Обратите внимание, что когда игла находится в субретинальном пространстве, при нажатии на поршень будет ощущаться небольшое сопротивление. Сопротивления не будет, если игла проткнет сетчатку, но высокого сопротивления, если игла не проникнет в склеру или СИЗОД. Еще одним важным этапом является инъекция, направленная на субретинальное пространство.

Это должно быть достигнуто без проникновения через нейросенсорную сетчатку в полость стекловидного тела. Подождите несколько секунд, прежде чем вынимать иглу, чтобы свести к минимуму обратный поток. Затем промойте глаз стерильным физиологическим раствором и убедитесь, что глаз вернулся в нормальное положение.

Затем нанесите толстый слой офтальмологического крема с тройным антибиотиком на поверхность роговицы введенного глаза. После этого поместите мышь в чистую одиночную клетку для восстановления. Следите за его дыханием и температурой во время восстановления после анестезии и убедитесь, что он может поддерживать лежачее положение за грудиной.

Проведите дополнительное соответствующее послеоперационное наблюдение и лечение, включая подкожную инъекцию карпрофена, для послеоперационного обезболивания. Вот 3D-реконструкция куполообразного пузыря в месте инъекции. Затем куполообразный пузырь заполняется плотным белым цветом, чтобы показать степень и края отслойки сетчатки.

Поперечные срезы сетчатки от ОКТ можно увидеть белым цветом, в то время как заполненное жидкостью пространство на уровне РПЭ и фоторецепторов кажется черным. На этом рисунке показаны репрезентативные снимки ОКТБ в месте максимальной отслойки сетчатки до инъекции, через 10 минут после инъекции и через четыре недели после инъекции. На этом изображении показано формирование и разрешение плоского пузырька от инъекции 0,3 микролитра.

На этом изображении показано формирование и разрешение куполообразного пузыря при введении 0,5 микролитра, в то время как на этом изображении показано формирование и разрешение куполообразного пузыря при введении одного микролитра. Наконец, вот пример сильного рубцевания хориоидеи и истончения сетчатки в месте инъекции. Сетчатка сохраняет нормальную функцию после разрешения пузырьков.

При девяти интенсивностях освещения показаны формы волн для опосредованных скотопическими стержнями реакций до инъекции и через четыре недели после инъекции при инъекциях 0,3 мкл, 0,5 мкл и 1 мкл. После освоения этой техники она может быть выполнена за 10-15 минут на глаз. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно оценить здоровье глаз перед ее началом.

Исключите глаза с помутнением роговицы или хрусталика, или глубоко посаженные глаза, для которых эта процедура будет очень сложной. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ОКТ и визуализация глазного дна, чтобы оценить качество инъекции.