Разработка изысканный протокола для транс склеры субретинальное трансплантации эпителиальных клеток человека пигмента сетчатки глаза крыс

Субретинальное инъекции широко применяется в доклинических исследованиях стволовых клеток заместительной терапии для age-related macular вырождения. В этой статье визуализировать мы описываем техника менее рискованным, воспроизводимые и именно изменение субретинальное инъекции через транс склеры подход к доставить клетки крыс глаза.

Общая цель этого видео заключается в том, чтобы представить воспроизводимую технику транссклеральной субретинальной инъекции для доставки клеток пигментного эпителия сетчатки человека, или РПЭ, в субретинальное пространство глаз грызунов с минимальным риском повреждения сетчатки. Для этого сначала делается небольшой разрез в височной конъюнктиве позади лимба для обнажения нижележащей склеры. Затем скошенная инсулиновая игла 31-го калибра используется для проникновения в комплекс ядра склеры путем введения иглы на 500 микрон или примерно половины кончика в ткань скошенной стороной вверх для создания пилотного отверстия.

Затем скошенная инъекционная игла 33-го калибра, прикрепленная к шприцу, направляется в пилотное отверстие и вставляется под определенным углом и на определенную глубину, отверстие для инъекции самогерметизируется после того, как игла втягивается, и не требуется шов или тканевый клей. Дегенеративные ретинопатии включают в себя широкий спектр заболеваний, поражающих различные типы клеток сетчатки. Во всем мире наиболее распространенное заболевание, возрастная макулярная дегенерация, или ВМД, встречается среди пожилых людей и приводит к постоянной слепоте.

Патологические изменения, происходящие при ВМД, включают начальную дегенерацию пигментных эпителиальных клеток сетчатки, или РПЭ. Потеря РПЭ приводит к дисфункции или смерти флуорорецепторов сетчатки. Современные фармакологические методы лечения ранней стадии ВМД ограничиваются замедлением прогрессирования или облегчением симптомов.

Это в сочетании с ограниченным регенеративным потенциалом сетчатки означает, что эффективного лечения для восстановления зрения не существует. Институт нейронных стволовых клеток недавно идентифицировал популяцию взрослых стволовых клеток в популяции клеток RPE. Эти клетки могут быть использованы в качестве источника для заместительной терапии стволовыми клетками.

В настоящее время наш институт проводит доклинические исследования для изучения эффективности и безопасности трансплантации стволовых клеток РПЭ на животной модели дегенеративной крысы РПЭ. В этом исследовании мы использовали транссклеральную технику субретинальной инъекции для доставки стволовых клеток RPE в глаза крысы между слоями сетчатки и RPE. Наш метод является простым и надежным средством для успешной доставки клеток в субретинальное пространство.

Вам понадобятся следующие реактивы и оборудование. 1% тропикамид и 2,5% фенилэфрин, свежеприготовленные из 10% фенилэфрина, путем разведения его в стерильном 0,9% физиологическом растворе в день операции, используются для расширения зрачка. Средство для промывания глаз используется для промывания глаза и поддержания влажности непрооперированного глаза.

Для увлажнения неоперированного правого глаза во время операции используется глазная смазка. 0,5% пропаракаина используется в качестве местного анестетика. Во время ОКТ-сканирования на прооперированный левый глаз наносится глазная смазка.

Для этой техники необходимо минимальное количество материала и оборудования. Подробная информация об оборудовании и реагентах, используемых в данной методике, изложена в протоколе. Для введения клеток используется шприц объемом 10 микролитров.

Перед инъекцией мы сначала собираем инжектор и стерилизуем его этанолом. Вставьте стерильную иглу со скошенной фаской 33 калибра в шприц и плотно закрутите, чтобы собрать инжектор. Промойте инжектор 100% этанолом, затем 70% этанолом, а затем деионизированной дистиллированной водой, последовательно по пять-шесть раз каждый.

Отметьте иглу инъектора стерильным черным маркером на расстоянии 600 мкм от кончика иглы. Наденьте инжектор на микроманипулятор для использования в инъекциях. Клетки РПЭ человека подготавливаются в день операции и хранятся в смеси ледяной воды.

Аккуратно растирайте клеточную суспензию и загружайте в инжектор 1,2 микролитра, дополнительные 0,2 микролитра используются для компенсации обратного потока впрыска, чтобы гарантировать объем одной микролитр инъекции. Замените инжектор, заполненный суспензией ячеек, на микроманипуляторе или попросите помощника держать его вертикально, так как элементы РПЭ имеют тенденцию легко тонуть в растворах. Подготовьте стерильную операционную зону, поместив стерильную операционную прокладку с грелкой под столик для препарирующего микроскопа.

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете штата Нью-Йорк в Олбани. Взвесьте животное и обезболите его с помощью системы доставки паров изофлурана, как показано здесь. Перенесите крысу в операционную зону после того, как она будет обезболивана, и поместите ее в носовой конус, подключенный к системе изофлурана, для поддержания анестезии.

Накройте тело крысы марлей и зажмите палец ноги крысы, чтобы подтвердить полную анестезию. Нанесите каплю глазной смазки на правый глаз крысы, положите крысу на правый бок так, чтобы ее левый глаз был обращен к потолку для инъекции, головой к правой руке хирурга, а спиной к хирургу. Обрежьте все усы, которые закрывают глаз.

Капните небольшое количество жидкости для промывания глаз на височную сторону левого глаза, а излишки соберите с носовой стороны с помощью ватного аппликатора, чтобы промыть глаз. Расширьте зрачок с помощью 1% тропикамида и 2,5% фенилэфрина для проведения постинъекционной оптической когерентной томографии или ОКТ-исследования, нанеся по одной капле каждого. Нанесите каплю средства для промывания глаз, чтобы сохранить глаза влажными.

Нанесите каплю Пропаракаина на глаз и удалите излишки с помощью ватного аппликатора. Аккуратно помассируйте кожу вокруг глаза от четырех до шести раз, чтобы открыть веко, чтобы глаз временно и слегка выскочил из своей глазницы, чтобы обеспечить легкий доступ к игле для инъектора. С усилием захватите конъюнктиву позади лимба и поверните глаз, чтобы найти лучшее место для операции, не повреждая глазные мышцы.

Аккуратно приподнимите конъюнктиву, чтобы получилась палатка, и поверните глаз носом. Затем ножницами срезать верхнюю часть палатки, сделать небольшое отверстие в конъюнктиве и обнажить склеру. Затем с помощью щипцов возьмитесь за край отверстия конъюнктивы рядом с лимбом, и поверните глаз носом так, чтобы ось зрачка находилась под углом около 30 градусов относительно земли.

Стерильная скошенная инсулиновая игла 31-го калибра используется для проникновения в комплекс ядра склеры со скосом, направленным вверх, и половиной кончика, или около 500 микрон, вводимым в ткань, для создания пилотного отверстия для инъекции. Осторожно извлеките иглу инсулина, и может быть замечен небольшой выпот крови. Для прочистки отверстия и остановки кровотечения при необходимости можно применить глазное копье.

Направьте иглу инжектора, загруженную клеткой RPE, в пилотное отверстие под углом приблизительно от 10 до 15 градусов относительно локальной поверхности склеры, чтобы достичь субретинального пространства, введя иглу длиной 500 мкм полностью в ткань и оставив расстояние 100 микро между точкой на игле, которая покрыта тканью, и точкой черного маркера на игле. Скажите помощнику, чтобы он нажал на поршень шприца, чтобы ввести соответствующий объем клеток. Удерживайте инжектор на месте в течение 25–30 секунд после инъекции, затем медленно втяните инжектор.

Отверстие для впрыска герметизируется автоматически, и обычно наблюдается небольшое количество обратного потока около 0,2 микролитра. Трижды промойте место укола стерильным средством для промывания глаз, а излишки соберите ватным аппликатором. Нанесите каплю лубриканта на прооперированный глаз и перенесите крысу на станцию ОКТ, чтобы изучить расположение трансплантированных клеток и размер субретинального пузыря.

Верните крысу в клетку для восстановления под тепловой лампой, чтобы сохранить температуру ее тела после завершения ОКТ. Наблюдайте за крысой, чтобы убедиться, что она выходит из наркоза, и ежедневно следите за любыми признаками дистресса. Немедленно сообщите ветеринару, если есть опасения.

Используя нашу методику, мы последовательно и успешно доставляем клетки RPE человека в субретинальное пространство. Сразу после трансплантации мы провели ОКТ-исследование для наблюдения за местом инъекции и субретинальным пузырем, созданным трансплантированными клетками. Это служит хорошим инструментом скрининга для оценки качества инъекций и степени повреждения сетчатки или кровоизлияния.

Яркое отражение света вокруг места инъекции и субретинальный пузырь, заполненный клеточной суспензией, можно было увидеть при ОКТ-сканировании. При успешной инъекции вокруг места инъекции или интравитреального пространства не наблюдается кровотечения, утечки межглазной жидкости или отслоения сетчатки, что свидетельствует о минимальной травме, вызванной инъекцией. Прооперированные глаза крыс были зародышены, зафиксированы и разрезаны для иммуногистологического анализа через семь дней после трансплантации.

Для обнаружения трансплантированных клеток были использованы человеческий ядерный маркер Hunu и клеточный маркер RPE, OTX2. Положительное констатирование обоих маркеров показало, что трансплантированные клетки RPE человека были расположены в субретинальном пространстве глаз крысы. Эта техника транссклеральной субретинальной инъекции проста и легка в освоении.

Он вызывает меньшую хирургическую травму и оставляет сетчатку нетронутой за счет прохождения инъекционной иглы через внешние слои стенки глаза, не повреждая нервную сетчатку. Количественно определенные капли для ввода пилотной иглы и инъекционной иглы в ткань, а также угол, используемый во время инъекции, позволяют надежно доставлять клетки в субретинальное пространство с гораздо более высокой точностью и вероятностью успеха. С помощью этого метода инъекции мы последовательно и успешно доставляли клетки RPE, полученные из стволовых клеток человека RPE, в субретинальное пространство крыс RCS.

Эту процедуру может легко повторить любой, кто посмотрит видео.