Модифицированный MicroSecure Витрификация: Безопасный, простой и очень эффективная процедура криоконсервации для человека бластоцисты

Общая цель метода витрификации эмбрионов MicroSecure заключается в обеспечении безопасной, надежной, простой, но эффективной процедуры асептической закрытой витрификации для эмбрионов человека. Этот метод был разработан для минимизации переменных контроля качества при витрификации человеческих эмбрионов, что обеспечивает надежный и воспроизводимый успех. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она стремится устранить технические различия между биологами и лабораториями.

Наша методика настолько проста в исполнении, что самой большой проблемой для наших слушателей является обучение пипетированию эмбрионов без их потери. Идея нашего метода заключалась в том, чтобы устранить необходимость в специализированных устройствах путем адаптации двух часто используемых продуктов, одобренных FDA. Иономерная соломинка для хранения с внутренней маркировкой и стерильный флексипет.

Наглядная демонстрация этой методики чрезвычайно полезна, так как она выделяет основные советы, которые обеспечивают ее успешное применение. Перед началом процедуры поместите стерильную соломинку для спермы объемом 0,3 мл на тефлоновую поверхность электрода базового настольного импульсного герметика, прямо перед пробкой, чтобы создать внутреннюю герметизацию. Нажмите на ручку, чтобы активировать нагрев, отпуская ручку, когда красный индикатор погаснет и раздастся звуковой сигнал.

Затем прижмите ватную пробку к внутреннему уплотнению, прежде чем завершить настройку. Для криоразведения и загрузки образцов в бластоцисты извлеките чашку для культуры пациента из инкубатора и подтвердите все идентификации образцов вторичным источником. Под стереомикроскопом используйте витрификационный флексипет, называемый вит-наконечником, чтобы переместить бластоцисты в отдельные удерживающие капли в верхнем ряду соответствующей криочашки.

Далее предварительно заполните флексипет 3 микролитрами раствора V1 и выдавите половину содержимого на первый эмбрион. Аспирируйте эмбрион и перенесите его в первую каплю V1. Затем пипеткой нанесите зародыш два-три раза по периметру капли и удалите остаточное содержимое пипетки за пределами капли на поверхность чашки.

Затем переместите бластоцисту в отдельную удерживающую каплю V1 и предварительно загрузите наконечник вита следующим раствором V2 перед пипетированием дополнительных эмбрионов новым вит-наконечником. После промывки всех бластоцист в каплях V2 и V3, как показано выше, удалите остаточный раствор и пузырьки с кончика вита за пределами капли, содержащей V3, и полностью заполните кончик чистым раствором V3 примерно с первого эмбриона. Вытолкните примерно 1 микролитр объема и полностью аспирируйте бластоцисту и оставшийся раствор V3 в кончик вита.

Теперь извлеките наконечник из пипетки и с помощью стерильной марлевой салфетки высушите остатки раствора V3 с внешней поверхности наконечника вита. Сушка внешней поверхности наконечника имеет решающее значение и не влечет за собой никакого дополнительного риска потери эмбриона. Затем вставьте конец кончика сначала в открытый конец предварительно запечатанной соломинки и переверните соломинку, промаркируя ее концом вниз.

Следите за кончиком у внутренней пробки. Оставьте воздушное пространство толщиной 1 см на открытом торце, а затем надежно заварите его. Когда все соломинки будут запечатаны, погрузите их непосредственно в жидкий азот в флягу Дьюара из нержавеющей стали и храните соломинки в открытом кубке, прикрепленном к трости пациента.

Для элюирования и разбавления криораствора поместите соответствующую чашку для разбавления с шестью лунками в центр предметного столика стереомикроскопа, а чашку Петри диаметром 60 мм с согревающей ванной сахарозой 37 градусов Цельсия — с одной стороны микроскопа. Затем изолируйте соломинку, которую нужно согреть, и удерживайте верхнюю соломинку над уровнем жидкости, чтобы подтвердить принадлежность образца. Используйте ножницы для майонеза, чтобы закрепить соломинку под внутренней пробкой, чтобы кончик вита был погружен в жидкий азот.

Несколько раз сильно постучите ножницами по фляге Дьюара, чтобы отобрать кончик от внутренней боковой стенки соломинки в качестве меры предосторожности для контроля качества, и поднимите соломинку в атмосферный воздух в горизонтальной ориентации рядом с поверхностью стереоскопа или под ней. Взявшись за немаркированный конец соломинки, разрежьте соломинку у внутренней пробки. Затем поднимите соломинку над согревающей посудой для ванны и высыпьте кончик вита в ванну под углом 60 градусов, пока кончик полностью не выдавится.

Основание флексипета должно располагаться над боковой стенкой посуды. Через 5–10 секунд перенесите основание пипетки в устройство для пипетирования с микроколпачком. Запустите пятиминутный таймер.

Во время просмотра в микроскоп указательным пальцем закройте отверстие груши и осторожно сожмите луковицу, чтобы выпустить витрифицированную бластоцисту из кончика вита в промывку T1. После подтверждения выхода бластоцисты очистите остаточный раствор V3 и пузырьки с помощью положительного давления, откачав содержимое в центр неиспользованной лунки для выброса. Перенесите наконечник вита на пипетку Стербера, переместив эмбрион во вторую каплю Т1 под масло на оставшиеся четыре минуты.

Во время инкубации предварительно заполните флексипит следующим раствором, затем разведите бластоцисту в каплях Т2, 3 и 4 с интервалом в три минуты. Наконец, уравновесьте бластоцисты в капле Т5 в течение пяти минут на поверхности с температурой 37 градусов Цельсия, прежде чем вернуть их в инкубатор. Модифицированная система классификации бластоцисты Гарднера рассматривает полные бластоцисты как имеющие менее 10% грыжи клеток трофэктодермы, в то время как бластоцисты с грыжей до 50% классифицируются как расширенные.

Бластоцисты, которые демонстрируют грыжу более 50%, считаются вылупляющимися. Используя продемонстрированные методы криоконсервации и согревания, высокие уровни живорождений в начале цикла были последовательно достигнуты с предимплантационным генетическим тестированием или без него. Хотя эти успехи заметно выше, при использовании предварительно отобранных эуплоидных бластоцист.

Действительно, оценивая популяцию пациентов с хорошим прогнозом только для криоконсервированных циклов, эти данные о переносе замороженных эмбрионов демонстрируют лучшие показатели успеха, чем в среднем по стране, как по имплантации, так и по живорождению более чем на 30%. независимо от возраста, были достигнуты, по сравнению с недавними национальными статистическими данными, представленными Центром по контролю заболеваний для двух других уважаемых клиник по лечению бесплодия, и данными, опубликованными Обществом вспомогательных репродуктивных технологий. Витрификация MicroSecure — это новая асептическая процедура, разработанная с учетом технической простоты, надежности и криобезопасности. Эта простая, некоммерческая система остекловывания представляет собой высокоэффективную и недорогую альтернативу устройствам для остекловывания.

С момента своего развития метод MicroSecure обеспечил более 99,9% восстановления эмбрионов и более 95% полной выживаемости бластоцисты. Это позволило за последние три года трансформировать нашу клиническую практику практически во все циклы криоконсервации эмбиропереноса. Мы эффективно модифицировали нашу процедуру, включив внутреннее уплотнение перед ватной пробкой из соломинок из иономерной спермы, чтобы по-прежнему обеспечивать надежные сварные швы и выдающиеся результаты после нагрева.

Сегодня в индустрии вспомогательных репродуктивных технологий используется множество различных систем устройств, но ни одно другое устройство не предлагает такой простоты и технической повторяемости, чтобы существенно исключить вариации пользователя и обеспечить оптимизированную безопасность, как микробезопасная витрификация.