Изучение динамических процессов наноразмерных объектов в жидкости с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа

Общая цель жидкофазной сканирующей просвечивающей электронной микроскопии заключается в наблюдении структур и явлений наноматериалов в биологических образцах, полностью погруженных в жидкий слой толщиной до нескольких микрометров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области материаловедения, такие как поведение наноматериалов в жидкости и изучение биологических образцов в естественной жидкой среде. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предоставляет наноразмерную морфологическую информацию об образцах в жидкости.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что загрузка держателя образца и получение изображения не так просты, как это делается сначала с помощью электронной микроскопии. Чтобы начать процедуру, в чистом ламинарном проточном колпаке очистите предметное стекло для световой микроскопии салфеткой без волокон и чистым этанолом. Поместите предметное стекло на салфетку из чистой комнаты в чашку Петри с крышкой.

Чтобы манипулировать микрочипами SiN, с помощью пинцета с углеродным покрытием возьмите микрочип крепко, но осторожно с длинных сторон, постоянно держа мембрану SiN обращенной вверх. Используя эту методику, поместите на предметное стекло пять микросхем без прокладки и пять микросхем с 200-нанометровой проставкой. Закройте чашку Петри и поднесите микрочипы к вытяжному шкафу.

Поместите микрочипы в стакан из ацетона ВЭЖХ мембраной вверх. Аккуратно поворачивайте стакан в течение двух минут, чтобы снять защитное покрытие, стараясь не перевернуть микрочипы. Затем быстро перенесите микрочипы в стакан с чистым этанолом.

Накройте стакан алюминиевой фольгой. Аккуратно покрутите стакан в течение двух минут, чтобы закончить снятие покрытия, и поднесите его в закрытой чашке Петри к вытяжке с ламинарным потоком. Поместите микрочипы на свежую салфетку для чистой комнаты, стараясь не переворачивать микрочипы, когда они высвобождаются из пинцета.

Дайте микрочипам высохнуть в течение нескольких минут. А затем поместите микрочипы на предметное стекло в чашку Петри. Закройте чашку Петри и поднесите микросхемы к плазменному очистителю.

Поместите предметное стекло и микрочипы в очиститель плазмы и запустите пятиминутную программу очистки для удаления углеводородов с мембраны SiN. С помощью светового микроскопа осмотрите микрочипы на наличие разрывов мембран или частиц грязи. Выбросьте поврежденные или загрязненные микрочипы.

В колпаке с ламинарным потоком обездвижите микрочипы в чистом транспортировочном боксе с липкой внутренней поверхностью. Нанесите каплю размером в один микролитр трехмолярного раствора стабилизированных водным методом наночастиц золота на мембрану SiN каждого микрочипа без спейсера и дайте раствору высохнуть. Затем нанесите на мембрану один микролитр деионизированной воды, чтобы смыть соль и поверхностно-активные вещества.

Через 30 секунд с помощью фильтровальной бумаги аккуратно промокните воду и дайте микрочипам высохнуть. Поместите наконечник держателя ПЭМ потока жидкости под бинокулярный световой микроскоп. Снимите титановую крышку с наконечника держателя и поместите ее на лист алюминиевой фольги.

Установите микрофлюидный шприцевой насос со стеклянным шприцем объемом один миллилитр, содержащий 0,5 миллилитра воды класса ВЭЖХ. Подсоедините шприц к проточной системе и запустите насос. По мере того, как вода промывается через систему, проверьте трубопроводы на наличие утечек или сужения потока.

Когда сцеживание будет завершено, извлеките ополаскиватель из отсека для жидкостей и вытрите наконечник держателя фильтровальной бумагой. Осмотрите наконечник держателя с помощью светового микроскопа. Высушите наконечник салфеткой для чистых помещений и удалите пыль или волокна чистым пинцетом с покрытием из ПТФЭ.

Осмотрите крышку с наконечником держателя, уплотнительное кольцо и винты, а также удалите пыль или волокна пинцетом с покрытием из ПТФЭ. Поместите уплотнительное кольцо в группы держателей. Установите первый винт и поверните его несколько раз, чтобы он просто остался.

С помощью чистого изогнутого пинцета поместите микрочип образца в карман наконечника держателя мембраной SiN вверх. С помощью бинокулярного микроскопа убедитесь, что микрочип установлен правильно. Поместите каплю 0,3 микролитра чистой фильтрованной воды на микрочип образца.

Удерживаем микрочип на месте с помощью пинцета. Затем возьмите в руки микрочип с изогнутым пинцетом, который держите вверх ногами. Осторожно поверните пинцет так, чтобы мембрана микрочипа была обращена вниз.

Поместите микросхему-распорку на микросхему образца. Поместите светоотражающий материал под наконечник держателя и проверьте выравнивание микросхемы под бинокулярным световым микроскопом. Используйте пинцет для тщательной регулировки микросхем, если окна SiN не выровнены.

Затем поднимите крышку камеры для образцов пинцетом. Переверните крышку вверх дном, и, не касаясь микрочипов, упритесь тыльной стороной крышки в наконечник держателя. Поместите оставшийся винт с помощью пинцета и затяните оба винта итеративным образом.

Осторожно затяните, пока они не встретят сопротивление. Окна могут легко разбиться, если закручивание слишком сильное. Запустите поток жидкости со скоростью четыре микролитра в минуту через систему и проверьте наличие утечек в наконечнике держателя.

Затем поднесите держатель к вакуумной насосной станции и выполните проверку на герметичность. Следите за тем, чтобы давление достигло не менее 10 до отрицательной пятой мбар в течение пяти минут. Поместите держатель в его корпус.

И поднести держатель к электронному микроскопу. Установите микроскоп в режим STEM. Измерьте текущую плотность электронного пучка с помощью тонкой углеродной пленки, покрытой наночастицами золота, в качестве эталонного образца без воды.

Запустите подачу чистой воды со скоростью не более двух микролитров в минуту. Вставьте держатель потока жидкости TEM в вакуумный загрузочный замок и начните вакуумирование. Следите за тем, чтобы давление нормально снижалось.

А затем полностью вставить держатель ПЭМ в микроскоп. Как только давление станет достаточно низким, откройте клапан луча и вставьте детектор АПД. Установите микроскоп в режим непрерывной съемки и переместите предметный столик образца в направлениях X и Y, чтобы найти окно SiN.

Отрегулируйте контрастность и яркость так, чтобы края окна были хорошо видны. Переместите сцену в направлениях X и Y так, чтобы угол окна находился в центре поля зрения. Затем установите линзу объектива.

Отрегулируйте вертикальное положение предметного столика, чтобы сфокусировать угол. Наклоняйте предметный столик на пять градусов вперед и назад, чтобы убедиться, что образец находится на эуцентрической высоте. Центрируйте угол окна в поле зрения, а затем сохраните положение рабочей области в программном обеспечении.

Перемещайте столик в направлениях X и Y, пока не станут видны наночастицы золота. А затем сфокусируйте объектив. Обратите внимание на плотность тока и рассчитайте толщину жидкой ячейки.

Переместите столик в направлениях X и Y, чтобы найти область, содержащую не менее 20 наночастиц золота. Задайте параметры и получите изображение. Наночастицы золота иммобилизуются на мембране из нитрида кремния и визуализируются с помощью жидкофазного STEM.

В чистой воде наночастицы золота сохраняли свою форму на протяжении всей визуализации. Продукты радиолиза из воды могут окислять отдельные атомы золота, что в конечном итоге может изменить форму наночастиц. В другом эксперименте ионы хлора мы вводим в жидкую фазу.

Наночастицы золота медленно растворялись в ходе эксперимента, поскольку окисленные атомы золота образовывали растворимый тетрахлорауреат. Чтобы исследовать движение наночастиц золота в воде, в последующем эксперименте наночастицы не были полностью иммобилизованы на мембране образца. Наночастицы золота агломерировались и, достигнув критического размера кластера, вышли из поля зрения.

После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если она выполнена правильно. Потребуется несколько недель обучения. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно работать спокойно и проверять герметичность вакуума и толщину жидкости.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области материаловедения, химии и биологии для изучения роста и движения наночастиц в жидкости, структуры наноразмерных материалов в жидких средах и функциональности белков в клетках млекопитающих. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить сканирующую просвечивающую электронную микроскопию наночастиц золота, внедренных в слой воды, включая правильную загрузку держателя образца и регулировку микроскопа. Не забывайте, что работа с жидкостью в электронном микроскопе может привести к повреждению, если держатель образца будет неправильно загружен.

Поэтому важно проверить наличие утечки вакуума перед загрузкой.