На месте TEM биологических ассамблей в жидкости

Общая цель этой процедуры — получить изображение биологических сборок и жидкости для наблюдения за их динамическим поведением с нанометровым разрешением. Это достигается путем предварительной подготовки микросхем из нитрида кремния с аффинной поверхностью захвата, позволяющей привязывать макромолекулы к поверхности микрочипа, предотвращая диффузию в жидкости. Второй шаг — загрузка биологических образцов на микрочип с целью вербовки частиц ротавируса.

Затем микрочип, содержащий вирусные частицы, промывают контрастным веществом, а затем загружают в микрофлюидный держатель образца. Последним шагом является загрузка верхней стружки и лицевой пластины, чтобы сформировать закрытый сосуд, в котором находится жидкий образец. В конечном счете, изображения записываются в ПЭМ, чтобы выявить особенности образца вируса в жидкой микрокамере.

Основное преимущество этой методики перед другими существующими методами исследования объектов в жидкости заключается в том, что наш образец не диффундирует быстро на большие расстояния, в то время как при визуализации происходит аффинный захват покрытия, нанесенного на микрочипы? Применение этого метода распространяется на оценку в реальном времени систем доставки лекарств на основе наночастиц или разработку вакцин против вирусных патогенов, потому что мы впервые можем увидеть, как динамические наномашины изменяются в растворе. Хотя этот метод может дать представление о визуализации биологических макромолекул, он также может быть применен к другим системам, таким как электрохимические приложения.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Так как подготовка устройств аффинного захвата и загрузка держателя образца микрожидкости могут представлять проблему для начинающего пользователя. Для начала очистите чипсы из нитрида кремния, инкубировав их в 15 миллилитрах ацетона в течение двух минут, а затем в 15 миллилитрах метанола в течение двух минут.

Чтобы удалить остатки фоторезиста, используемого в процессе изготовления, дайте стружке быстро высохнуть под ламинарным потоком воздуха. После высыхания высушите чипсы на тарелке, нагретой до 150 градусов Цельсия, в течение 1,5 часов. Затем дайте им остыть до комнатной температуры.

Далее с помощью шприцев Гамильтона составьте липидную смесь в небольшой стеклянной пробирке. Сначала добавьте 25% хлороформа, затем добавьте 55% DLPC в хлороформ из расчета один миллиграмм на миллилитр. И, наконец, с помощью отдельного шприца добавьте 20%-ный липид никелевого NTA в хлороформе из расчета один миллиграмм на миллилитр на общий объем 40 микролитров.

Затем отрежьте кусочек парама, чтобы он поместился внутри стеклянной чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров, и добавьте девять капель воды Milli Q по 15 микролитров на поверхность парама. Нанесите аликвоту липидной смеси в размере одного микролитра на каждые 15 микролитров воды Milli Q и поместите пластину на лед во влажной среде не менее чем на 60 минут, пока на поверхности капель не образуется монослой липидов. Поместите EIP со встроенным 150-нанометровым прокладкой поверх монослойной капли и инкубируйте их вместе в течение одной минуты.

Затем аккуратно оторвите чип от капли и добавьте три микролитра меченого белка А в концентрации 0,01 миллиграмма на миллилитр непосредственно на поверхность чипа. Инкубируйте чипсы и белок А в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем промокните лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги Ватмана номер один и немедленно добавьте три микролитра раствора антитела IgG в дозе 0,01 миллиграмма на миллилитр.

Инкубируйте образец в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем удалите излишки раствора с помощью шприца Гамильтона и немедленно добавьте в него аликвоту ротавируса объемом один микролитр ротавируса, двухслойные частицы по 0,1 миллиграмм на миллилитр в буферном растворе кучи и инкубируйте чип не менее двух минут при комнатной температуре. Второй плоский IP получают путем разрядки свечения в течение одной минуты, собирают микрофлюидную камеру с помощью ST. Стереоскоп путем предварительной загрузки наконечника камеры образца уплотнительными кольцами.

Затем загрузите влажный E IP, содержащий вирусный образец, в наконечник микрофлюидного держателя образца. Затем добавьте плоский накаленный разряд EIP поверх образца, сэндвичьте всю сборку вместе, чтобы сформировать герметичный корпус, механически удерживаемый на месте внутри держателя тремя латунными винтами. После сборки прокачайте наконечник держателя до 10 до минус шести тор.

Используя сухую насосную станцию с турбонасосом, перед установкой держателя внутрь ПЭМ загрузите держатель I двух образцов в просвечивающий электронный микроскоп, оснащенный лабораторной шестинитью накала, работающим под напряжением 120 киловольт. Затем включите филамент TEM и отрегулируйте центрическую высоту предметного столика микроскопа по отношению к образцу, используя функцию воблера для наклона образца на минус 15 градусов до плюс 15 градусов вперед и назад. В столбце записывают от 6 000 до 30 000 кратного увеличения изображения по краям и в угловых областях микрофлюидной камеры.

Первое изображение получено с помощью ПЗС-матрицы в условиях низкой дозы от одного до трех электронов на ангстрем в квадрате. Определите правильное значение расфокусировки, сфокусировавшись на краю жидкостной камеры. Как правило, используйте значение расфокусировки минус 1,5 микрометра для записи изображений с 30 000-кратным увеличением, чтобы убедиться, что раствор содержится в микрофлюидной камере.

На протяжении всего эксперимента фокусируйте электронный луч до тех пор, пока в жидкости внутри устройства не сформируются пузырьки. Показанное здесь изображение было получено через две минуты при соотношении пяти электронов на ангстрем в квадрате. Через пять минут образуется еще больше пузырьков тлеющего разряда, микросхемы связываются.

Очень мало двухслойных частиц в растворе, предположительно из-за диффузии. Для сравнения, двухслойные частицы обогащены аффинными декорированными микрочипами, показанными здесь репрезентативными изображениями и 3D-реконструкцией двухслойных частиц в жидкости, содержащей контрастный реагент. Диаметр реконструкции составляет 80 нанометров.

Средние значения классов двухслойных частиц и жидкости выявили четко определенные особенности вдоль их внешней поверхности. Отдельные панели имеют глубину 110 нанометров. При выполнении этой процедуры важно не забыть отцентрировать E IPS на кончике держателя образца и подготовить держатель перед тем, как вставить его в электронный микроскоп.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как оценка транскрипционной активности, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, в какой степени электронный луч повлиял на функциональную способность вирусных комплексов? После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как производить устройства аффинити-захвата, украшать их молекулярными адаптерами, загружать образцы вирусов в микрофлюидный держатель TEM и визуализировать образцы с помощью процедур CCHE микроскопии. Не забывайте, что работа с вирусными патогенами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении процедур с двумя патогенами BSL всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков.