Сканирующей электронной микроскопии (SEM) Протоколы для Проблемной завода, оомицет и грибковые Образцы

Целью этой методологии является обработка нежных тканей растений, оомицетов и грибов для их оптимального наблюдения под сканирующим электронным микроскопом (СЭМ). Этот метод может помочь нам ответить на вопросы, касающиеся практически любых грибов, микробов, болезней, а также того, как они заражают, колонизируют и прикрепляются к своему хозяину. Техника в нашей усовершенствованной методологии предназначена для фиксации образцов, где ми-то-мин в водных экосистемах.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет визуализировать ключевые аспекты заражения с помощью дорогостоящих и легкодоступных ресурсов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что шаги были сильно изменены по сравнению с традиционными протоколами. А опубликованные методики описывают общие процедуры без подробностей.

Для начала приготовьте формол и уксусный спирт или фиксатор FAA в вытяжном шкафу, оснащенном альдегидным фильтром. По 85 частей 70% денатурированного этанола, 10 частей 60% раствора формальдегида и пять частей ледяной уксусной кислоты. Под вытяжной шкаф высыпьте запас FAA в отдельные емкости.

Выберите цветочные или вегетативные меристемы для фиксации, убедившись, что они не повреждены насекомыми, грибками или экстремальными погодными условиями. Обрежьте ветки, удалив нежелательный материал, и немедленно поместите образец в раствор FAA. Через 72-96 часов вылейте FAA в пластиковый контейнер для утилизации химикатов.

Немедленно промойте образцы три раза свежим 70%-ным этанолом, чтобы удалить остатки FAA. Фиксированный материал можно хранить в неограниченном количестве 70% этанола. Препарируйте образцы в чашке Петри, покрытой этанолом, чтобы предотвратить высыхание тканей.

Используйте чашку Петри с основанием, покрытым сухим черным силиконом, чтобы лучше видеть контрастную белую ткань. Переложите салфетку в отдельные контейнеры, а затем погрузите их в чашку Петри с 70% этанолом. Накройте контейнеры крышками и поместите их в пластиковую центрифужную пробирку с большим количеством этанола 70%.

Переведите расчлененный материал через серию этанола в герметичных банках или центрифужных пробирках. Оставьте образцы в каждом растворе не менее чем на один час. Затем оставьте образцы на ночь в растворе 100% этанола.

После серии этанола перенесите контейнеры с материалом в CPD. Напишите идентификационный номер образца под держателями образцов SEM. Затем накройте верх огрызков двусторонним скотчем.

Поместите огрызки в держатель для образцов. Под стереомикроскопом осторожно откройте контейнеры с молодыми и хрупкими образцами, уже высушенными в CPD. Имейте в виду, что после обработки CPD образцы становятся более легкими и чувствительными к электростатике.

После извлечения проб закройте контейнеры, чтобы избежать попадания пыли или загрязнений. Положите образцы на липкую поверхность огрызков, заранее планируя желаемое положение. После того, как образцы соприкоснулись с поверхностью, удалить их очень сложно.

Не пытайтесь проводить серьезное вскрытие на этом этапе. Просто удалите нежелательную ткань, которую легко взять в руки. Для палинологических исследований рассеките пыльники и вскройте их, чтобы обнажить пыльцу на пнях.

Храните образцы в защищенном месте в течение ночи в герметичном контейнере с силикагелем, чтобы избежать повторной гидратации. Нанесите на образцы слой с помощью споттера-коутера и перенесите их в SEM, как описано в текстовом протоколе. Чтобы проверить дифференциальный рост шипиков кист на отдельных чашках Петри, нанесите 0,5 миллилитра вторичной суспензии кисты на разные поверхности.

Поверхности могут включать углеродные, золотые и медные просвечивающие электронные микроскопические сетки. Раньше отбеливали чешую лосося и хека, а также стеклянную крышку слипов. Инкубируйте цисты при температуре 20 градусов Цельсия в течение 70 минут, что способствует прикреплению цисты к поверхности.

Удалите жидкость и добавьте по 0,5 миллилитра 2%-ного глутаральдегида на каждую поверхность для фиксации кист. Храните образцы при комнатной температуре в вытяжном шкафу в течение часа. Удалите глутаральдегид и обезвожьте образцы с помощью этанолового ряда, добавив по пять миллилитров каждого из растворов этанола в течение 15 минут.

Попав в последний раствор 100% этанола, образец может храниться до месяца в герметичной чашке Петри. Осторожно перенесите сетки и весы из чашки Петри в держатель, подходящий для CPD, который удерживает образцы отдельно друг от друга, например, держатель сетки CPD или держатель для штабелирования образцов. Возьмите сетку и чешуйки с помощью пинцета, помня о том, что кисты всегда должны быть обращены вверх на сетку.

Приступайте к сушке материала с помощью CPD перед выполнением СЭМ-пробоподготовки ооцитов, чтобы наблюдать за их поведением на различных поверхностях, как описано в текстовом протоколе. Тщательно оберните каждый образец фильтровальной бумагой, формируя примерно от 0,5 до одного квадратного сантиметра конверты с карандашными этикетками. Будьте осторожны, чтобы не раздавить образцы.

Запечатайте фильтровальную бумагу скрепками. Затем перенесите упакованные образцы в чашку Петри и погрузите их в 10 миллилитров воды, чтобы регидратировать ткани вокруг спор. Сразу же поместите образцы в микроволновую печь.

Удалите материал, как только вода начнет испаряться, и дайте ему остыть при комнатной температуре. Затем пропустите образец через серию этанола. В зависимости от количества образца для этого этапа используйте стакан или центрифужную пробирку.

Оставьте образцы на 15 минут в каждом растворе. Затем поместите образцы в CPD, как описано в текстовом протоколе. Чтобы установить споры для наблюдения SEM, откройте конверты.

Затем соберите споры с липкой поверхностью пней, стараясь не раздавить их. Наконец, выполните золотое покрытие образцов и наблюдение СЭМ, как подробно описано в текстовом протоколе. Здесь показаны цветочные бутоны anacyclus clavatus, обработанные тетраоксидом осмия и приготовленные с использованием протокола FAA CPD, продемонстрированного в этом видео.

Также показаны высушенные образцы феллоринии геркуланы без какой-либо обработки, а также споры грибов, обработанные так, как показано в этом видео. Этот рисунок иллюстрирует раннее, среднее и позднее развитие цветков, зафиксированное в рамках SEM. На этом снимке показан вид сверху молодого ре-кима.

Здесь показан цветочный бутон во время дифференциации гинезиума и цветок в цветке. Некоторые структуры может быть трудно зафиксировать и сохранить для визуализации в соответствии с SEM. Примеры включают те, которые происходят из влажной среды, а также структуры с орнаментами и с покровом.

Здесь показаны дифференциальные модели роста колючек saprolegnia parasitica на чешуе стекла, углерода, меди, золота, хека и лосося. Это видео, показывающее бесполый жизненный цикл saprolegnia parasitica. Бесполый жизненный цикл важен для расселения этих организмов в их водной или влажной среде.

Кроме того, образующиеся на этой стадии зооспоры представляют собой первичную единицу инфекции у паразитических видов отряда сапролегниалов. Хотя освоить эту технику можно за три-пять дней, она выполняется правильно. Мы использовали деньги, чтобы завершить терапию SEM для внешнего использования в этот период времени в Королевском ботаническом саду в Мадриде.

Посмотрев это видео, исследователи будут знать, как эффективно собирать и фиксировать хрупкий биологический материал для наблюдения за СЭМ. Разрушение клеток, деформация органов или плохая сохранность образцов из влажной среды могут быть легко преодолены с помощью этой процедуры. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что наблюдение с помощью SEM ограничено исследованием поверхностей с большим увеличением.

Кроме того, перед обработкой CPD уплотнения должны быть защищены от шокирующих изменений и прямого контакта с воздухом. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области фитологии к изучению структуры спор во время инфекционного процесса, особенно у видов, представляющих интерес для рыболовства. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как просвечивающая микроскопия или ТМ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова внутренняя структура клеточного состава в конкретных органах или клетках, или пыльца.

Не забывайте, что манипуляции с формалином и глутаральдегидом могут быть чрезвычайно опасными, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа под вытяжным шкафом и использование масок, лабораторных халатов и перчаток.