Метод подготовки образцов сканирующего и трансмиссионного электронного микроскопа для придатков woodboring Beetle

Деревянный жук их поверхность тела всегда трудно в SEM. Tween-20 добавляется в фиксатор и стиральный раствор. Поверхность тела древесного жука В TEM, Tween-20 может увеличить фиксаторное проникновение в стенку тела и лучше исправить ткани и органы в организме.

Флуоресцентный микроскоп полезен для повышения точности нарезки. Техника полезна для мытья поверхности тела и проникновения в стенку тела в деревянном жуке. Таким образом, было бы ясно SEM и TEM видения.

Флуоресцентный микроскоп полезен для повышения точности нарезки в TEM. Демонстрацией процедуры будет Чжан Янру, аспирант нашей лаборатории. В районе, где живут chlorophorus caragana, поместите полевые ловушки, наживки с растительными притягательами, такими как изофорон, на воронку.

Привлекайте взрослых жуков-лесополос в ловушки. Сохранить чистые тела взрослого Chlorophorus caragana в 0,1 моль на литр PBS при рН 7,2, 2,5%вес по объему глутаралдегид, и 0,06%объем по объему Tween-20. Исправьте образец при четырех градусах по Цельсию в течение трех дней.

Удалить тела из жидкости сохранения и промыть в PBS. Под стерео микроскопом используйте тиски для удаления придатков и ультрасонически очищайте их при 40 килогерцах в PBST. После очистки в течение 100 секунд, передать образец в микроскоп, чтобы проверить, если он чист.

Не очищайте дольше 400 секунд, чтобы избежать повреждений. Затем погрузите образцы этанола в ряд концентраций в течение 20 минут каждый для выполнения обезвоживания. После обезвоживания, под стерео микроскопом, используйте углеродную двустороннюю клейкую ленту, чтобы отдельно зафиксировать три поверхности наблюдения, спинную, вентальную и боковую, на заглушки.

Убедитесь, что все смотровые поверхности будут чистыми и свободными от загрязнения. Поместите этап образца в чашку Петри, содержащую кремнеземный гель desiccant в течение 48 часов. Затем, на ионные распыления инструмент, поверните основной клапан в открытое положение, удалить крышку камеры образца и положить образец в камеру.

Включите выключатель питания и убедитесь, что готовый свет выключен. Установите время распыления как 45 секунд и толщина покрытия как 70.875 angstrom. После того, как механический насос вакуумный циферблат индекс падает ниже семи, нажмите разряда и начать распыление платины.

В конце процедуры выключите электроснабжение и вывехив образец из камеры. Рассчитайте толщину спрей-пленки D в ангстреме, равный K раз, когда я раз V раз T.K является постоянным определяется распыленного металла и газа. Я плазменный поток в миллиамперах в то время как V является напряжение применяется в киловольтах и Т это время в секундах.

Вставьте заглушку, содержащую образец, на сцену SEM. Убедитесь, что этап образца с заглушкой образца имеет достаточно высоты, чтобы обеспечить хорошее изображение. Откройте программное обеспечение SEM и выберите желаемое операционное напряжение, начиная с 20 киловольт.

После получения придатков от взрослых Chlorophorus caragana, мыть образцы в PBST в ультразвуковой ванне в течение трех часов, а затем пост-исправить их в 1%weight по объему осмия тетроксида в PBS в течение одного часа при 25 градусах по Цельсию. Обезвоживать образцы с помощью 20-минутных последовательных процедур в 50%60%70%80%85%90%95%100%и 100%volume по объему этанола при комнатной температуре. С типсами нанесите нагретую смолу в плоскую встраиваемую форму и встраиваем образцы в смолу.

Убедитесь, что образец находится в нижней части пластины и помещен как можно ближе к краю утопленной канавки. Этикетка, а затем инкубировать пластины, содержащие образец при 60 градусов по Цельсию в течение 72 часов. После инкубации удалите пластину из инкубатора и убедитесь, что смола полимеризована.

После того, как образец затвердеет, поместите каждый блок смолы под флуоресцентный микроскоп, перемести флуоресцентный источник света микроскопа, чтобы облучить образец синим светом сверху и сфотографировать их. Убедитесь, что сенсилла в блоке смолы хорошо видны. Измерьте расстояние между краем блока смолы и датчиком цели для целевой сенсиллы.

Обратитесь к SEM изображение пальпы и примерно сократить смолы блок с лезвием бритвы близко к целевому рецептору. Затем, под синюю световую микроскопию флуоресценции, отрегулируйте источник света сверху так, чтобы сенсилла наблюдалась четко. Добавьте объективный микрометр к стадии флуоресценции микроскопа.

Фотография примерно вырезать смолы блока, а затем с помощью ImageJ измерить расстояние между целью и краем смолы. Поместите образец смолы на ультрамикротом и вырежьте 50-60 нанометров толщиной до тех пор, пока не будет достигнуто целевое положение. Намонтировать секции на formvar покрытием 100 сетки медных сеток в чашках Петри.

Пятно сетки с насыщенным фильтрованным раствором уранил ацетата при комнатной температуре. Обложка разделов во время окрашивания, чтобы блокировать свет индуцированных осадков. Пятно в течение 10 минут.

В дымовой капот, промыть дважды в 50%метанол, а затем дважды в фильтрованной дегазации воды. Поместите капли подготовленного свинца цитрат пятно на квадратах пластиковых чашек Петри и дайте им сидеть в течение восьми минут. Промыть в дегазации фильтрованной воды и высушить.

Намонтировать сетки на образец сцены в машине TEM. Установите напряжение до 80 киловольт и изучите секции. В этом протоколе, используя очистку и фиксаторное решение с Tween-20, наблюдалось четкое изображение SEM, чем без Tween-20.

С Tween-20 фиксируя разрешение позволяющ раствор фиксации glutaraldehyde прорезать ткань, структуры microtubule были ясно увидены в изображении TEM пока внутренняя структура образца подготовленного без Tween-20 была размыта. Непрерывные поперечные виды колышек типа 1 sensilla twig basiconica на челюстно-максиллярных пальп показали, что дендритная оболочка окружала внешние дендритные сегменты и распространилась на кончик поры. Семь небранных внешних дендритных сегментов существовали внутри внутренней лимфы рецептора, которая была окружена внешней полостью.

Трубчатое тело было отделено дендритной оболочкой от других внешних дендритных сегментов на каждом основании чувствительности розетки. В цилиарной области было выявлено восемь дендритов разного диаметра, указывающих на наличие восьми биполярных нейронов. Техника может быть использована для дальнейшего изучения функции нервов, таких как одноклеточная запись или на месте гибридизации.