Измерение функции нервно-Джанкшен

Общая цель данной процедуры заключается в изучении функциональности нервно-мышечных соединений с помощью экспериментального подхода ex vivo. Это достигается путем стимуляции препарата мышцы с нервом двумя способами: непосредственно через мембрану мышцы и через нерв. Поскольку мембранная стимуляция обходит механизмы нейротрансмиссии, любые различия между двумя сократительными ответами могут рассматриваться как косвенный показатель функциональности нервно-мышечного соединения.

Здесь мы представляем данную процедуру на препарате камбаловидной мышцы и седалищного нерва. Мышца выделяется вместе с нервом и помещается в перфузионную камеру. Она фиксируется в контроллере силы и длины, а пара платиновых электродов располагается параллельно мышце.

Затем стеклянный всасывающий электрод перемещают вплотную к срезанному концу нерва. После этого применяется комплексный протокол тестирования для тщательной оценки функциональности как нервно-мышечного соединения, так и мышцы. Функциональная связь между мышцей и нервом подтверждается для обеих частей и двух сохранившихся фракций.

В первой области каждого из двух участков ткани обнаруживаются нервно-мышечные синапсы, которые в норме имеют характерную морфологию. Однако при ряде патологических состояний функциональное взаимодействие между мышцей и нервом серьезно нарушается, и нервно-мышечные синапсы утрачивают свою сложную морфологическую организацию. Основная цель нашей процедуры заключается в изучении функциональности нервно-мышечных синапсов с использованием экспериментального подхода ex vivo.

Это достигается путем стимуляции препарата нерва и мышцы двумя способами: одним — путем прямой стимуляции мембраны мышцы, другим — путем стимуляции нерва с последующим анализом свойств мышцы. Включите циркуляционный водяной термостат и установите температуру 30 °C.

Заполните ванночку раствором Кребса-Рингера. Пропускайте газовую смесь под давлением 0,4 bar через окситрубку в ванночку. Включите датчик актуатора и два импульсных стимулятора.

Установите значения тока на 300 млн пар для стимуляции мембраны и на 5 млн пар для стимуляции нерва. После умерщвления мыши путем перелома шейных позвонков удалите кожу с ног. Перережьте ахиллово сухожилие и, крепко зажав сухожилие, потяните икроножную и камбаловидную мышцы вверх вместе.

После обнажения проксимального сухожилия камбаловидной мышцы отсеките всю голень выше него и быстро поместите образец в подготовительную тканевую ванну, расположенную под стереомикроскопом. С помощью пинцета плотно зажмите проксимальное сухожилие камбаловидной мышцы и осторожно потяните его, чтобы обнажить седалищный нерв. После обнажения нерва удалите окружающие ткани, чтобы открыть около пяти миллиметров нерва.

Затем с помощью тонких ножниц осторожно перережьте нерв. Завершите иссечение мышцы и нерва, перерезав ахиллово сухожилие, чтобы отделить камбаловидную мышцу от икроножной мышцы. Теперь препарат мышцы и нерва готов к установке на испытательную установку.

Завяжите скользящий узел на конце нейлоновой нити и затяните его вокруг ахиллова сухожилия. Закрепите проксимальный конец сухожилия в фиксирующем зажиме и привяжите нейлоновую нить к рычагу датчика силы. Дайте мышце прийти в равновесие в растворе.

Для определения начальной оптимальной длины стимулируйте мышцу серией одиночных импульсов, осторожно изменяя значение нагрузки при ползучести. Оптимальная длина достигается при максимальной силе сокращения. Расположите вакуумные электроды рядом с мышцей и втяните нерв.

Затем, осторожно изменяя значение импульсного тока, стимулируйте мышцу серией одиночных импульсов. Сила сокращения, возникающая в мышце при стимуляции через нерв, должна быть равна значениям, измеренным при стимуляции самой мембраны. После определения оптимального значения тока извлеките нерв из электрода и подайте несколько импульсов тока.

Если величина предварительно выбранного тока избыточна, импульсы тока, подаваемые через всасывающий электрод, вызывают сокращение мышцы за счет прохождения тока через ванну. С помощью разработанного нами программного обеспечения мы создали автоматизированный протокол тестирования для изучения функциональности нервно-мышечных соединений камбаловидной мышцы. Протокол длится около 65 минут и состоит из четырех различных частей.

В первой части мышцу стимулируют четырьмя одиночными импульсами: двумя прямыми и двумя через нерв. Затем по полученным ответам на сокращения измеряют время достижения пика, время полурасслабления, максимальное значение производной силы и силу одиночного сокращения.

Во второй части мышца стимулируется серией пачек импульсов с частотой от 20 hertz до 80 hertz, что соответствует тетанической частоте. Это необходимо для построения кривых зависимости силы от частоты как при стимуляции нерва, так и при прямой стимуляции мышцы. В третьей и четвертой частях протокола мышца подвергается двум парадигмам утомления для измерения сбоев нейропередачи и внутритетанического утомления.

В ходе этих парадигм утомления мышца подвергается непрерывной стимуляции: сначала подается один пакет импульсов на мембрану, после чего следуют 14 пакетов импульсов через нерв. Вся последовательность повторяется 20 раз. Первая парадигма выполняется при частоте разрядов 35 hertz.

Второй этап проводится на тетанической частоте 80 Гц. Считается, что нарушение нейротрансмиссии играет важную роль в развитии утомления, так как оно связано с внешним блоком распространения потенциала действия, снижением высвобождения нейромедиатора и снижением возбудимости постсинаптической мембраны нервно-мышечного синапса. Другим аспектом утомляемости нервно-мышечного соединения является четко выраженное внутритетаническое утомление, которое представляет собой оценку способности мышцы поддерживать силу при одном тетаническом сокращении и отражает высокочастотное утомление.

В конце протокола измеряют чистую длину и вес мышцы с помощью аналогового штангенциркуля и прецизионных весов для вычисления площади поперечного сечения мышцы. Исследования на трансгенной модели мышей SOD1 с боковым амиотрофическим склерозом подчеркнули потенциал данной методологии. В частности, трансгенные камбаловидные мышцы демонстрируют сниженный сократительный ответ как по производной силы, так и по тетанической силе при прямой стимуляции, и еще более выраженное снижение при стимуляции через нерв.

Что касается, например, тетанической силы, эти эксперименты показали, что сократимость мышц обуславливает 25% повреждений, в то время как еще 45% связаны с дефектами нейропередачи. Другим интересным моментом является отсутствие каких-либо различий в контрольных мышцах при прямой или непрямой стимуляции. Этот результат доказывает, что методология не вызывает никаких технических артефактов, поскольку ожидается, что нервно-мышечное соединение у контрольных животных полностью функционально.

Что касается интратетанической утомляемости, результаты показали значительно более низкие значения в трансгенных камбаловидных мышцах по сравнению с соответствующими контрольными образцами. Примечательно, что трансгенная камбаловидная мышца подвергается значительному повреждению при повторяющей стимуляции, а это означает, что функциональность нервно-мышечного соединения можно оценивать при максимальном времени стимуляции до восьми минут. По истечении восьми минут при стимуляции трансгенная мышца возвращается к почти нулевому значению силы.

После просмотра видео вы должны были понять, как измерять функциональность нервно-мышечного соединения и состояние камбаловидной мышцы мыши. Поскольку данный метод основан на косвенном измерении функциональности нервно-мышечного соединения, он не позволяет определить, связаны ли зарегистрированные дефекты с морфологическими или биохимическими изменениями. С другой стороны, этот подход представляет собой важный способ оценки того, влияют ли данные повреждения на функциональность передачи нейронного сигнала.

Наконец, предлагаемый протокол может быть легко адаптирован для оценки функциональности нервно-мышечных соединений диафрагмы — другой мышцы, часто вовлеченной в патологические процессы.