Измерение функции нервно-Джанкшен

Функциональной оценки нервно-Джанкшен (NMJ) может обеспечить важную информацию о связи между мышц и нервов. Здесь мы описываем протокол всесторонне оценить функциональность NMJ и мышц, с использованием двух различных мышц нерва препаратов, т.е. камбаловидной седалищного нерва и диафрагма диафрагмального.

Общая цель этой процедуры заключается в изучении функциональности нервно-мышечного соединения с помощью экспериментального подхода ex vivo. Это достигается путем стимуляции подготовки мышечного нерва двумя способами: непосредственно на мышечной оболочке и через нерв. Поскольку мембранная стимуляция обходит передачу сигналов нейротрансмиссии, любые различия между двумя сократительными реакциями можно рассматривать как косвенное измерение функциональности нервно-мышечного соединения.

Здесь мы представляем эту процедуру в препарате камбаловидного седалищного нерва. Мышца рассекается вместе с нервом и помещается в ванну с перфузированными тканями. Он закреплен на регуляторе силы и длины, а платиновая пара электродов размещена параллельно мышце.

Затем стеклянный всасывающий электрод перемещается близко к перерезанному концу нерва. Затем применяется комплексный протокол тестирования для тщательной оценки как нервно-мышечного соединения, так и функциональности мышц. Функциональная связь между мышцей и нервом является выводом как для части, так и для двух выживших фракций.

В первой области уровня каждой из двух тканей сообщается о том, что эти нервно-мышечные соединения, которые в норме проявляют морфологию, подобную давлению. Тем не менее, при некоторых патологических состояниях функциональность между мышцами и нервами серьезно нарушена, и нервно-мышечное соединение теряет сложную морфологическую организацию. Общая цель нашей процедуры заключается в изучении функциональности нервно-мышечного соединения с помощью экспериментального подхода ex vivo.

Это достигается за счет стимуляции подготовки мышечных нервов двумя способами. Один путем непосредственной стимуляции мышечной мембраны, а другой путем стимуляции нерва и анализа мышечных свойств. Включите циркуляционную водяную баню и отрегулируйте температуру до 30 градусов по Цельсию.

Наполните ванну раствором Krebs-Ringer. Дайте газовой смеси в четвертой точке О протекать через кислородную трубку и попасть в ванну. Включите преобразователь привода и два стимулятора импульсов.

Установите значения тока равными 300 миллионам пар для стимуляции мембран и равными пяти миллионам пар для стимуляции нервов. Принеся мышь в жертву шейным вывихом, снимите кожу с ног. Теперь разрежьте ахиллово сухожилие и, плотно зажимая сухожилие, подтяните икроножную мышцу и камбаловидную мышцу вверх.

Как только проксимальное сухожилие камбаловидной кости обнажено, разрежьте всю икру над ним и быстро поместите образец в подготовительную тканевую ванну, расположенную под стереомикроскопом. С помощью пары щипцов плотно зажмите проксимальное сухожилие камбаловидной кости и аккуратно потяните его, чтобы обнажить седалищную иннервацию. Как только иннервация будет раскрыта, удалите окружающие ткани, чтобы открыть около пяти миллиметров нерва.

Затем с помощью тонких ножниц аккуратно перережьте нерв. Завершите иссечение мышцы, нерва путем разрезания ахиллова сухожилия, чтобы отделить камбаловидную мышцу от икроножной мышцы. Теперь мышечная, нервная подготовка готова к установке на испытательный аппарат.

Создайте на конце капроновой нити узел и затяните его вокруг ахиллова сухожилия. Зажмите проксимальный отдел сухожилия внутри неподвижного зажима и обвяжите нейлоновую проволоку вокруг рычага преобразователя силы. Позвольте мышце уравновеситься в растворе.

Чтобы определить начальную оптимальную длину, стимулируйте мышцу серией одиночных импульсов, мягко изменяя величину нагрузки ползучести. Оптимальная длина получается при максимальной силе подергивания. Поместите всасывающие электроды рядом с мышцей и втяните нерв внутрь.

Затем, мягко изменяя значение импульсного тока, стимулируйте мышцу серией одиночных импульсов. Сила подергивания, создаваемая мышцей при стимуляции через нерв, должна быть равна значениям, измеренным при ее стимуляции на мембране. Как только будет определено оптимальное значение тока, вытолкните нерв из электрода и подайте несколько импульсов тока.

Если величина ранее выбранного тока избыточна, то импульсы тока, подаваемые через всасывающий электрод, вызывают сокращение мышц, проводя ток через ванну. С помощью собственного программного обеспечения был разработан протокол автоматизированного тестирования для исследования функциональности камбаловидного нервно-мышечного перехода. Протокол длится около 65 минут и состоит из четырех различных частей.

В первой части мышца стимулируется четырьмя одиночными импульсами. Два доставляются напрямую и два через нерв. Время достижения пика, время полурелаксации, максимальное значение производной силы и сила подергивания затем измеряются по реакциям на подергивания.

Во второй части мышца стимулируется серией пульсовых последовательностей в диапазоне от 20 герц до 80 герц, что является тетанической частотой. Чтобы вычислить силу, частотные кривые как для нервной, так и для прямой стимуляции. В третьей и четвертой частях протокола мышца подвергается двум парадигмам усталости для измерения сбоя нейропередачи и интратетанической усталости.

Во время этих парадигм усталости мышца непрерывно стимулируется одной последовательностью импульсов, подаваемой на мембрану, за которой следуют 14 последовательности импульсов, доставляемых через нерв. Вся последовательность повторяется 20 раз. Первая парадигма поставляется с частотой срабатывания 35 Гц.

Второй на тетанической частоте 80 герц. Считается, что сбой нейропередачи играет важную роль в развитии усталости, поскольку он связан с распространением потенциала внешнего блока действия, уменьшением высвобождения и снижением высвобождения передатчика, а также с возбудимостью пластины и усталостной способностью перехода. Другой аспект утомляемости нервно-мышечных соединений четко выражается в интратанической усталости, которая является оценкой способности мышцы сохранять силу во время одного тетанического сокращения и отражает высокочастотную усталость.

В конце протокола чистая длина и вес мышц измеряются с помощью аналогового штангенциркуля и прецизионных весов для вычисления площади поперечного сечения мышц. Исследования трансгенной мышиной модели бокового амиотрофического склероза SOD1 выявили потенциал этой методологии. На самом деле, трансгенные камбаловидные мышцы демонстрируют сниженную сократительную реакцию как на производную силы, так и на тетаническую силу при прямой стимуляции, и еще большее снижение при стимуляции через нерв.

Что касается, например, силы тетании, эти эксперименты показали, что сократительная способность мышц составляет 25% повреждений, в то время как еще 45% связаны с дефектами нейропередачи. Еще одним интересным моментом является отсутствие какой-либо разницы в управляющих мышцах при прямой или косвенной стимуляции. Это открытие доказывает, что методология не вызывает никаких технических артефактов, поскольку ожидается, что нервно-мышечное соединение будет полностью функциональным у контрольных животных.

Что касается интратетанической усталости, результаты показали значительно более низкие значения в трансгенных камбаловидных мышцах, чем в их контрольных аналогах. Интересно, что трансгенная камбаловидная мышца значительно повреждается при повторяющейся стимуляции, а это означает, что функциональность нервно-мышечного соединения может быть оценена за максимальное время стимуляции в восемь минут. Через восемь минут трансгенная мышца возвращается к почти нулевому значению силы при стимуляции.

После просмотра видео у вас должно сложиться понимание того, как измерить функциональность нервно-мышечного соединения и камбаловидную мышцу мыши. Учитывая, что данная методика основана на косвенном измерении функциональности нервно-мышечного соединения, она не позволяет проводить ее там, где зарегистрированные дефекты связаны с морфологическими или биохимическими изменениями. С другой стороны, этот подход представляет собой важный способ оценить, влияют ли эти агрессии на функциональность пользовательского сигнала нейропередачи.

Наконец, предложенный протокол может быть легко принят для измерения функциональности нервно-мышечного соединения диафрагмы, еще одной мышцы, часто участвующей в патологических заболеваниях.