Оценка функционального нервно-мышечного соединения с помощью одновременной оптической стимуляции и видеозаписи

Начните с биореактора с мышечной камерой, содержащей коллагеновую мышечную ткань, поддерживаемую колоннами камеры.

Канал нейросферы содержит нейросферу в коллагеновой матрице. Моторные нейроны нейросферы экспрессируют светочувствительные каналы.

Добавьте среду для дифференцировки, содержащую факторы роста нейронов, которые стимулируют нейроны к расширению своих проекций.

Регулярно меняйте среду, чтобы обеспечить непрерывное продвижение нейронов по направлению к мышечной ткани, образуя нервно-мышечные соединения.

Наблюдайте за биореактором под микроскопом, оснащенным камерой и синим источником света.

Подавайте импульсы синего света, чтобы открыть светочувствительные каналы в нейронах, позволяя ионам из среды течь и стимулировать нейроны генерировать электрические сигналы.

Эти сигналы распространяются по нейронным проекциям к нервно-мышечным соединениям, передавая электрический сигнал мышечной ткани.

Записывайте видео одновременно. Постепенное сокращение мышечного волокна подтверждает развитие функционального нервно-мышечного соединения.

Приготовьте смесь 4 к 1 из 3 миллиграммов коллагена I на миллилитр и солюбилизированной матрицы базальной мембраны. Затем ресуспендируйте миобласты в этой свежеприготовленной коллагеновой смеси.

Затем добавьте по 15 микролитров этой клеточно-коллагеновой суспензии в каждую мышечную камеру биореактора, распределив суспензию по обоим столбам с помощью наконечника пипетки. Дайте клеточной гелевой смеси полимеризоваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем заполните каждую лунку биореактора 450 микролитрами миотонической питательной среды.

На 11-й день дифференцировки моторных нейронов перенесите клетки и среду в 50-миллилитровую трубку и дайте нейросферам осесть на дно в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 15 миллилитрах питательной среды для суспензии моторных нейронов с добавлением 20 нанограмм на миллилитр нейротрофического фактора головного мозга и 10 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеток.

На 14-й день протоколов дифференцировки засейте двигательные нейроны в платформу. Приготовьте гелевую смесь 4 к 1 из 2 миллиграммов на миллилитр коллагена I и солюбилизированной матрицы базальной мембраны. С помощью 400-нанометрового клеточного фильтра выберите крупные нейросферы, и ресуспендируйте их в приготовленной гелевой смеси.

Осторожно хорошо отсасывайте среды из водоема и нейросферы. Затем добавьте 15 микролитров гелевой смеси в канал нейросферы. Загрузите в пипетку объемом 10 микролитров 10 микролитров геля и выберите одну нейросферу. Поместите нейросферу в канал нейросферы, убедившись, что она находится в камере. Затем медленно поднимите пипетку, выпуская оставшийся гель после того, как нейросфера будет отложена.

Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте в резервуары 450 микролитров NbActiv4 с добавлением 20 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора мозга и 10 нанограммов на миллилитр нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеток.

Для визуализации используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп с научным программным обеспечением для дополнительной камеры на основе оксида металла. Установите биннинг на 2 на 2, экспозицию на 20 миллисекунд, плавающий затвор включен, скорость считывания на 540 мегагерц, динамический диапазон на 12 бит и коэффициент усиления 1, а режим сенсора на перекрытие. Используйте 2-кратный объектив на микроскопе для изображения микротканей и прикрепите камеру живых клеток к предметному столику микроскопа.

Выберите область интереса, содержащую иннервированные скелетные ткани, чтобы свести к минимуму размер файла и время обработки. Затем поместите 594-нанометровый длинночастотный эмиссионный фильтр между образцом и объективом изображения, чтобы отфильтровать импульсы синего света от камеры. Затем поместите прямоугольную четырехлуночную пластину, содержащую четыре биореактора, в камеру с живыми клетками. Затем нажмите Live View, центрируйте и сфокусируйте изображение с желаемой рентабельностью инвестиций.

Загрузите пользовательский макрокод из папки GitHub для управления положением сцены, платой Arduino и получением видео. Затем установите выходной фильм в качестве day_tissuegroup_tissuename_experiment. НД2. Запустите макрокод с нужными координатами x и y, установленными на рабочей области, и получите быстрый интервал из 1700 кадров со скоростью 50 кадров в секунду.

После визуализации замените носители и верните образцы в инкубатор. Во избежание усталости тканей между сеансами получения изображений должно пройти не менее 24 часов.