Быстрой патрон фильтра на основе 3D-система для первичной культуры клеток простаты дифференциацию

Общая цель этой 3D-системы культивирования первичных клеток пациента на основе фильтрующей вставки заключается в создании более биологически релевантной модельной системы in vitro для исследования рака предстательной железы. Используя первичные клетки человека, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологии развития предстательной железы, а также при раке предстательной железы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он представляет собой относительно быструю методологию in vitro для создания дифференцированных первичных клеток предстательной железы, которая также позволяет быстро выделить биомолекулы, такие как РНК, ДНК и белки.

Визуальная демонстрация этих методов имеет решающее значение, поскольку обработка клеток на фильтрующей вставке для гистологии или для сбора РНК и белков является деликатной и чувствительной ко времени. Чтобы ограничить диффузию между камерами в шкафу биологической безопасности, нанесите тонкий слой 0,1% желатина на нижнюю сторону вкладышей и дайте им высохнуть. Повторите эту процедуру еще два раза.

Затем поместите клетки во внутреннюю камеру вкладышей, покрытых желатином, и культивируйте их в течение двух недель. Через две недели нанесите фильтрующие вставки с культивированным фильтром непосредственно на одно из соответствующих последующих применений, описанных ниже. Чтобы начать эту процедуру, необходимо аспирировать PBS из внешней камеры и осторожно удалить PBS из внутренней камеры.

Культивированные вставки можно ненадолго держать в PBS до тех пор, пока нанесение не будет готово к нанесению, но не допускайте высыхания мембраны. Затем добавьте по 100 микролитров 0,25% трипсина ЭДТА в каждую внутреннюю камеру. Затем инкубируйте их в течение пяти минут при температуре 37 градусов по Цельсию.

После этого коротко и осторожно соскребите клетки на поверхности мембраны с помощью пипетки объемом 200 микролитров, одновременно пипетируя вверх и вниз. Затем инкубируйте их в течение одной минуты при температуре 37 градусов Цельсия. Через минуту добавьте 250 микролитров кондиционированного фильтрующего материала в первую внутреннюю камеру и осторожно промывайте пипеткой вверх и вниз, чтобы промыть фильтр.

После этого перенесите ресуспендированные элементы в соседнюю фильтрующую камеру, которая содержит те же условия фильтрующего материала, и повторите пипетирование вверх и вниз. Повторите эту процедуру для каждой из вставок одного условия. Затем соберите клетки и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров

Промойте каждую внутреннюю камеру еще 100-200 микролитрами кондиционированной среды, чтобы собрать оставшиеся клетки, и добавьте их в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем вращают клетки в микроцентрифуге при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. После этого аспирируйте надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу 1000 микролитров PBS.

Снова вращайте клетки в микроцентрифуге при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Через пять минут аспирируйте PBS и заморозьте образец при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего использования. В этой процедуре добавьте 200 микролитров гуанидиния, тиоцианата, фенола, хлороформа или аналогичного экстракционного реагента во внутреннюю камеру и кратковременно взбалтывайте клетки на поверхности мембраны путем пипетирования вверх и вниз.

Затем инкубируйте клетки в реагенте для экстракции в течение пяти минут при комнатной температуре и оставьте внешнюю камеру сухой. После этого промойте фильтрующую мембрану, пипетируя экстракционный раствор вверх и вниз. Соберите как можно больше экстракционного реагента, наклонив шестилуночную пластину и отсасывая остаточную жидкость.

Обратите внимание, что фильтр может отделяться от вставки. Промойте диссоциированную фильтрующую мембрану, если она прикреплена. Затем соберите как можно больше реагента для экстракции и следуйте протоколу производителя по очистке и восстановлению ДНК, РНК или белка.

Следует проявлять осторожность при промывке клеток и фильтрации тиоцианатом гуанидиния, так как чрезмерное перемешивание может привести к низкому качеству РНК. Чтобы изолировать белок от фильтрующего элемента, поместите фильтрующий вкладыш в шестилуночную пластину на льду. Затем добавьте во внутреннюю камеру 10 микролитров буфера для лизиса белка.

Взбалтывайте и соскабливайте клетки на поверхности мембраны с помощью пипетки объемом 20 микролитров во время пипетирования вверх и вниз, избегая образования пузырьков в буфере для лизиса. После этого инкубируйте шестилуночную пластину с фильтрующими вставками на льду в течение десяти минут. Повторите соскабливание, а затем промойте поверхность мембраны с помощью буфера для лизиса.

Соберите лизаты из шести вкладышей и переложите их в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду. Далее промойте первую мембрану дополнительными 10 микролитрами буфера для лизиса и передайте его следующему фильтру. Повторите эту процедуру для всех вставок заданного экспериментального состояния, собрав любой остаточный лизис буферного раствора и добавьте в 1,5-миллилитровую пробирку.

Инкубируйте образец на льду еще пять минут. Затем вращайте его на максимальной скорости в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Когда это будет сделано пипеткой, выведите лизат в свежую 1,5-миллиметровую пробирку.

Затем приступают к анализу концентрации белка или хранят лизаты при температуре минус 80 градусов Цельсия. При этом добавьте 500 микролитров и один миллилитр 10% NBF во внутреннюю и внешнюю камеру соответственно. Инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующий день отсадите NBF из внешней камеры и добавьте один миллилитр геля для обработки HEA в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку. Медленно растопите агарозу в микроволновой печи, используя малую мощность и повторяя 10-секундные импульсы, пока агароза не расплавится. Держите HEA в теплой ванне при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы предотвратить затвердевание до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

Далее извлеките NBF из внутренней камеры. Нанесите 25 микролитров расплавленного HEA на внутреннюю камеру и дайте агарозе застыть в течение двух-пяти минут. Затем смочите две поролоновые гистологические прокладки в 10% NBF и поместите одну прокладку в встраиваемую кассету.

Обеспечение целостности клеточных слоев на фильтрующей вставке с помощью HistoGel является критически важным этапом для сохранения неповрежденного клеточного слоя для гистологического среза. После этого скальпелем с помощью лезвия No 11 надрезать фильтр с нижней стороны пластиковой вставки камеры, частично отпуская ее. Поместите 100-200 микролитров NBF в чашку Петри и погрузите частично смещенный фильтр в NBF.

Скальпелем с номером 10 лезвия осторожно надавите на середину фильтра с внутренней стороны камеры вставки, чтобы полностью выбить фильтр из вставки цилиндра. Если какая-либо часть фильтра все еще прикреплена к стволу, разрежьте ее скальпелем. Впоследствии разрежьте фильтр с покрытием HEA пополам.

Поместите каждую половинку фильтра на поролоновую подушечку в подготовленную гистологическую кассету. Затем добавьте второй 10% пропитанный NBF бисквит в кассету, прослоив фильтр. Далее защелкой закройте кассету.

Поместите его в NBF и инкубируйте в течение ночи. На этом ярком полевом изображении видны многослойные клеточные слои на вершине пористой мембраны. Показаны отдельные флуоресцентные изображения ядер, P63 и андрогенного рецептора, а также слияние всех трех флуоресцентных маркеров.

Наконец, показано комбинированное наложение светлого поля и иммунофлуоресценции, устанавливающее локализацию флуоресцентного сигнала относительно клеток и фильтра. Здесь показано изображение поперечного сечения нашей фильтрующей вставки в сравнении со слоями протокового эпителия интактной простаты. После освоения этой техники это можно сделать за две недели, при этом окончательное выделение клеток и фильтрующей вставки или желаемой биомолекулы займет менее 30 минут при правильном выполнении.

При выполнении этой процедуры важно всегда помнить о необходимости проявлять осторожность при работе с фильтрующими вставками, чтобы не повредить слой клеток или нижележащий фильтр. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, микрочипы РНК и протеомные анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, относящиеся к анализу путей и раковым клеткам. Этот метод поможет исследователям в области рака предстательной железы лучше изучить биологию предстательной железы, а также основы рака предстательной железы с использованием первичных клеток предстательной железы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться отличное понимание того, как правильно настроить и восстановить культивируемые первичные клетки предстательной железы из этой 3D-системы культивирования.