Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле
24 января 2017 г.
Гигантские везикулы, содержащие сильно упакованные микрометровые компоненты, являются полезными моделями клеток. Метод центрифугирования на основе эмульсии «вода в масле» является простым и мощным инструментом для получения гигантских везикул с инкапсулированными материалами.
Общая цель этого метода центрифугирования на основе водно-масляной эмульсии заключается в том, чтобы легко получить гигантский пузырь тонкого слоя. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синтетической биологии, такие как создание искусственной клетки на основе гигантского везикулы. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 25 миллимолярный стоковый раствор DOPC и нулевой двухмиллимолярный стоковый раствор Texas Red DHPE в хлороформе.
Затем сформируйте липидную пленку на внутренней поверхности стеклянного флакона объемом пять миллилитров, испарив смесь стоковых растворов DOPC и Texas Red DHPE под протекающим газообразным азотом. После инкубации пленки при пониженном давлении в течение ночи добавьте в флакон один миллилитр жидкого парафина. Заверните флакон в алюминиевую фольгу и выдержите смесь при температуре 80 градусов Цельсия в течение ночи.
В микропробирке с крышкой один пункт пять миллилитров смешайте 237 целых пять микролитров нефлуоресцентных микросфер размером один микрометр и 12 целых пять микролитров флуоресцентных микросфер размером один микрометр. Теперь добавьте в микротрубку 64 миллиграмма сахарозы, а затем 125 микролитров одного молярного буферного раствора Tris и 875 микролитров деионизированной воды. Вонзайте смесь в течение 30 секунд, затем обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут.
После приготовления 10 миллилитров буферизованного раствора Tris поместите один миллилитр в микропробирку объемом пять миллилитров с крышкой. После того, как раствор был обработан и обработан ультразвуком, смешайте один миллилитр масляного раствора с 300 микролитрами внутреннего водного раствора в одной пятимиллилитровой микропробирке. Эмульгируйте два компонента в микротрубке с помощью механического гомогинизатора, работающего при 10 000 об/мин в течение двух минут при комнатной температуре.
Затем аккуратно нанесите 300 микролитров водно-масляной эмульсии на верхнюю поверхность одного миллилитра наружного водного раствора при температуре четыре градуса Цельсия в микропробирку объемом один балл пять миллилитров с крышкой. Сразу после охлаждения микропробирки в течение 10 минут центрифугировать смесь при 18 000 G в течение 30 минут. Когда закончите, получите осажденные гигантские везикулы или GV, проколов дно микротрубки нажимным штифтом и собрав одну каплю в стерилизованную микротрубку объемом пять миллилитров.
Поместите адгезивную инкубационную камеру для НК-2-полимеразной цепной реакции и гибридизации на верхнюю часть покровного стекла микроскопа. С помощью микропипетки нанесите 25 микролитров разбавленных осажденных GV на область образца и немедленно поместите покровное стекло толщиной пять миллиметров с нулевой точностью одной десятой пять миллиметров на верхнюю часть инкубационной камеры. После записи микроскопических изображений везикул проводят флуоресцентную микроскопию путем введения в микроскоп флуоресцентных зеркальных единиц UFBNA и UFMCHE.
Затем установите блоки с фильтрами возбуждения и фильтрами излучения для анализа. Наиболее важным фактором, определяющим успех метода «вода в масле», является то, что удельный вес внутреннего водного раствора должен быть больше, чем удельный вес внешнего водного раствора, чтобы ГВ выпадали в осадок во время центрифугирования. Дифференциальная интерференционная микроскопия и флуоресцентная микроскопия ГВ без микросфер и с микросферами подтвердили образование ГВ с низкой пластинчатостью.
Из 160 полученных GV 55 инкапсулированных микросфер и 105 были пустыми, что дало коэффициент инкапсуляции 34%. Объемная доля микросфер в GV была оценена примерно в 11 плюс-минус три объемных процента, а точность рассчитанной объемной доли составила от 10 до 30%. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как выяснение моделируемой клетки.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить гигантские пузырьки с помощью инкапсулированных материалов.
Обзор
В данной статье рассматривается способ приготовления гигантских везикул с помощью метода центрифугирования эмульсии типа «вода в масле». Такие везикулы служат полезными моделями для исследований в области синтетической биологии, в частности, для создания искусственных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Синтетическая биология
- Подготовка везикул
- Клеточные модели
Теоретическая часть
- Гигантские везикулы способны инкапсулировать вещества, что делает их ценными для исследований.
- Метод эмульсии «вода-в-масле» упрощает процесс приготовления.
- Понимание механизмов формирования везикул имеет решающее значение для развития синтетической биологии.
- Эффективность инкапсуляции является ключевым показателем при оценке данного метода.
Цель исследования
- Разработать простой метод приготовления гигантских везикул.
- Изучить потенциал использования данных везикул в приложениях синтетической биологии.
- Оценить возможность инкапсуляции различных материалов внутри везикул.
Используемые методы
- Приготовление липидных пленок из DOPC и Texas Red DHPE.
- Формирование эмульсий «вода в масле» с помощью механической гомогенизации.
- Центрифугирование для выделения гигантских везикул.
- Методы микроскопии для анализа свойств везикул.
Основные результаты
- Успешное формирование гигантских везикул с различной степенью инкапсуляции.
- Микросферы были инкапсулированы в 34% везикул.
- Объемная доля микросфер составила приблизительно 11%.
- С использованием того же протокола была успешно осуществлена инкапсуляция других материалов.
Выводы
- Метод «вода-в-масле» эффективен для приготовления гигантских везикул.
- Эффективность инкапсуляции может быть оптимизирована для различных областей применения.
- Данная методика открывает возможности для дальнейших исследований в области синтетической биологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективная инкапсуляция микросфер внутри гигантских везикул (ГВ) позволяет создавать модели искусственных клеток, что способствует развитию синтетической биологии на ранних этапах и поиску новых биофармацевтических препаратов. Данный метод обеспечивает воспроизводимую платформу для изучения компартментализации, молекулярного краудинга и эффективности инкапсуляции, которые имеют решающее значение для прогностической достоверности систем, имитирующих клетки. Этот подход непосредственно применим в процессах валидации мишеней и разработки анализов, где модели искусственных клеток используются для механистического снижения рисков и обеспечения трансляционной преемственности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Облегчает сборку моделей искусственных клеток снизу вверх для проверки гипотез.
- Позволяет инкапсулировать различные биомолекулы или частицы для имитации клеточного окружения.
- Способствует снижению механистических рисков за счет моделирования молекулярного краудинга и компартментализации.
- Обеспечивает платформу для функциональной валидации мишеней в синтетических системах.
Скрининг и разработка анализа
- Подготовка стандартизированных систем на основе везикул для последующих этапов скрининга.
- Предоставление количественных показателей инкапсуляции для обеспечения воспроизводимости анализа.
- Обеспечение масштабируемого производства везикул для применения в высокопроизводительном скрининге.
- Поддержка надежной оценки взаимодействий соединений или биомолекул внутри определенных компартментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирует значимые для заболевания клеточные особенности, такие как молекулярный краудинг и компартментализация.
- Позволяет согласовать системы искусственных клеток с трансляционными исследованиями биомаркеров при инкапсуляции соответствующих молекул.
- Обеспечивает преемственность от валидации синтетических моделей до разработки доклинических методов анализа.
- Снижает риски на ранних этапах исследований за счет возможности контролируемого количественного манипулирования системой.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод центрифугирования эмульсии «вода-в-масле» объединяет этапы раннего поиска и разработки анализа, позволяя создавать модели искусственных клеток для исследований на основе выдвинутых гипотез и проведения скрининга.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о компартментализации и эффективности инкапсуляции в синтетических системах.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных препаратов везикул для стандартизации анализов.
- Аналитика: позволяет измерять коэффициенты инкапсуляции и объемные доли для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяет переносить результаты, полученные на синтетических моделях, в дизайн доклинических анализов при инкапсуляции молекул, имеющих значение для патологии.
- Корпоративное использование: представляет собой воспроизводимый протокол, адаптируемый к различным инкапсулятам и составам везикул.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность анализов на основе искусственных клеток и валидации мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную и масштабируемую подготовку везикул с количественно измеримыми результатами.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения механистической неопределенности на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию проектов в области синтетической биологии и клетоподобных систем с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области химии липидов, работы с эмульсиями и микроскопического анализа.
- Необходим доступ к гомогенизаторам, центрифугам и инфраструктуре для флуоресцентной микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов инкапсуляции и анализа.
- Метод адаптируем к различным инкапсулятам и размерам везикул при условии оптимизации протокола.
- Эффективность инкапсуляции и ламеллярность везикул могут варьироваться и требуют эмпирического подтверждения.
