Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле

Гигантские везикулы, содержащие сильно упакованные микрометровые компоненты, являются полезными моделями клеток. Метод центрифугирования на основе эмульсии «вода в масле» является простым и мощным инструментом для получения гигантских везикул с инкапсулированными материалами.

Общая цель этого метода центрифугирования на основе водно-масляной эмульсии заключается в том, чтобы легко получить гигантский пузырь тонкого слоя. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синтетической биологии, такие как создание искусственной клетки на основе гигантского везикулы. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 25 миллимолярный стоковый раствор DOPC и нулевой двухмиллимолярный стоковый раствор Texas Red DHPE в хлороформе.

Затем сформируйте липидную пленку на внутренней поверхности стеклянного флакона объемом пять миллилитров, испарив смесь стоковых растворов DOPC и Texas Red DHPE под протекающим газообразным азотом. После инкубации пленки при пониженном давлении в течение ночи добавьте в флакон один миллилитр жидкого парафина. Заверните флакон в алюминиевую фольгу и выдержите смесь при температуре 80 градусов Цельсия в течение ночи.

В микропробирке с крышкой один пункт пять миллилитров смешайте 237 целых пять микролитров нефлуоресцентных микросфер размером один микрометр и 12 целых пять микролитров флуоресцентных микросфер размером один микрометр. Теперь добавьте в микротрубку 64 миллиграмма сахарозы, а затем 125 микролитров одного молярного буферного раствора Tris и 875 микролитров деионизированной воды. Вонзайте смесь в течение 30 секунд, затем обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут.

После приготовления 10 миллилитров буферизованного раствора Tris поместите один миллилитр в микропробирку объемом пять миллилитров с крышкой. После того, как раствор был обработан и обработан ультразвуком, смешайте один миллилитр масляного раствора с 300 микролитрами внутреннего водного раствора в одной пятимиллилитровой микропробирке. Эмульгируйте два компонента в микротрубке с помощью механического гомогинизатора, работающего при 10 000 об/мин в течение двух минут при комнатной температуре.

Затем аккуратно нанесите 300 микролитров водно-масляной эмульсии на верхнюю поверхность одного миллилитра наружного водного раствора при температуре четыре градуса Цельсия в микропробирку объемом один балл пять миллилитров с крышкой. Сразу после охлаждения микропробирки в течение 10 минут центрифугировать смесь при 18 000 G в течение 30 минут. Когда закончите, получите осажденные гигантские везикулы или GV, проколов дно микротрубки нажимным штифтом и собрав одну каплю в стерилизованную микротрубку объемом пять миллилитров.

Поместите адгезивную инкубационную камеру для НК-2-полимеразной цепной реакции и гибридизации на верхнюю часть покровного стекла микроскопа. С помощью микропипетки нанесите 25 микролитров разбавленных осажденных GV на область образца и немедленно поместите покровное стекло толщиной пять миллиметров с нулевой точностью одной десятой пять миллиметров на верхнюю часть инкубационной камеры. После записи микроскопических изображений везикул проводят флуоресцентную микроскопию путем введения в микроскоп флуоресцентных зеркальных единиц UFBNA и UFMCHE.

Затем установите блоки с фильтрами возбуждения и фильтрами излучения для анализа. Наиболее важным фактором, определяющим успех метода «вода в масле», является то, что удельный вес внутреннего водного раствора должен быть больше, чем удельный вес внешнего водного раствора, чтобы ГВ выпадали в осадок во время центрифугирования. Дифференциальная интерференционная микроскопия и флуоресцентная микроскопия ГВ без микросфер и с микросферами подтвердили образование ГВ с низкой пластинчатостью.

Из 160 полученных GV 55 инкапсулированных микросфер и 105 были пустыми, что дало коэффициент инкапсуляции 34%. Объемная доля микросфер в GV была оценена примерно в 11 плюс-минус три объемных процента, а точность рассчитанной объемной доли составила от 10 до 30%. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как выяснение моделируемой клетки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить гигантские пузырьки с помощью инкапсулированных материалов.