Изготовление Трехмерная бумаги на основе микрожидком Устройства для иммуноанализа

Общая цель этого протокола — продемонстрировать наш процесс изготовления трехмерных устройств на бумажной основе, которые мы используем в качестве платформы для разработки иммунологических анализов на месте оказания медицинской помощи. Этот метод обеспечивает бумажную микрофлюидную платформу с надежным производственным процессом, так что время и усилия могут быть направлены на разработку анализов, а не на проектирование устройств. Основное преимущество нашей методики заключается в том, что она позволяет готовить множество устройств параллельно и в количестве, желательном для академических исследовательских проектов.

Как правило, новые пользователи будут испытывать трудности с этим методом, потому что при изготовлении устройств необходимо учитывать множество переменных, таких как правильное выравнивание слоев. Ошибки могут привести к сбоям в работе устройств. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что сборку может быть трудно представить, используя только детали, представленные в рукописях.

Во-первых, подготовьте слои качественной фильтровальной бумаги, разрезав стандартный лист бумаги на стандартный размер бумаги, чтобы облегчить нанесение рисунка с помощью воскового принтера. Загрузите отрезанный лист бумаги в лоток принтера. Затем распечатайте ранее созданные слои.

Затем разрежьте стоковый ряд нейлоновой мембраны на листы с помощью настольного резака для бумаги, уделяя большое внимание обращению с нейлоновой мембраной, чтобы сохранить ее целостность и защитить от разрыва. Храните любой неиспользованный материал в корпусе с эксикатором, так как нейлоновые мембраны чувствительны к влаге. Используя восковой принтер, распечатайте шаблон слоя захвата на листе копировальной бумаги и прикрепите его к световому коробу, который будет служить ориентиром для позиционирования нейлоновой мембраны.

После этого положите чистый лист копировальной бумаги на ранее распечатанный лист копировальной бумаги. Приклейте чистый лист бумаги к световому коробу, но не склеивайте два листа вместе. Теперь поместите отрезанный лист нейлоновой мембраны на чистый лист копировальной бумаги, убедившись, что мембрана покрывает отпечатанную область нижнего слоя копировальной бумаги.

Приклейте со всех четырех сторон нейлоновую мембрану к чистому листу копировальной бумаги. Загрузите лист нейлоновой мембраны, поддерживаемый прикрепленной к нему копировальной бумагой, в лоток принтера с ручной подачей. Затем печатайте по одному листу нейлоновой мембраны за раз.

Наклейте напечатанные слои на акриловую рамку для равномерного нагрева выше и ниже слоя при помещении в гравитационную конвекционную печь. Теперь поместите слои в духовку при температуре 150 градусов Цельсия на 30 секунд, пока воск не растает в толще бумаги. Вынув бумагу из духовки, убедитесь, что воск проник по толщине бумаги, перевернув ее и проверив на наличие дефектов в дизайне.

Снимите бумажную и капроновую мембрану с акриловой рамки. Затем снимите нейлоновую мембрану с опорного листа копировальной бумаги с помощью резака для бумаги. Выкройте двусторонние листы из клеевых пленок с помощью роботизированного ножевого плоттера с заранее подготовленными файлами дизайна.

слой бумаги с рисунком, который нужно подложить клеем, на световой короб печатной стороной вниз. Снимите с одной стороны защитный вкладыш от листа клея. Прижмите лист с выкройкой клея и слой бумаги вместе.

Затем поместите частично собранное устройство в защитный чехол. Затем пропустите полученную двухслойную сборку через автоматизированный ламинатор, чтобы полностью прижать клей и бумагу вместе, удалив любые воздушные карманы из прилегающих слоев. Наклейте сопряженный слой на акриловую раму таким образом, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона находилась в подвешенном состоянии и не соприкасалась с рамой.

Добавьте 2,5 микролитра БСА и один X PBS в гидрофильную зону на сопряженном слое. Дав образцу высохнуть при комнатной температуре в течение двух минут, высушите его при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. После этого добавьте пять микролитров наночастиц коллоидного золота с пятью OD, конъюгированных с антителами против бета-ХГЧ, затем повторите процесс сушки.

Наклейте слой бокового канала на акриловую раму таким образом, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона находилась в подвешенном состоянии и не соприкасалась с рамой. Добавьте 10 микролитров блокирующего средства для обработки бокового канала, затем повторите тот же процесс сушки, который использовался для сопряженного слоя. Затем наклейте захватывающий слой на акриловую раму таким образом, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона была подвешена и не соприкасалась с рамой.

Обработайте захватывающий слой пятью микролитрами антител против альфа-ХГЧ. Дав образцу высохнуть при комнатной температуре в течение двух минут, высушите его при температуре 65 градусов Цельсия в течение восьми минут. Добавьте два микролитра блокирующего средства, затем повторите тот же процесс сушки, который использовался для захватывающего слоя.

Приклейте слой смывки к световому коробу напечатанной стороной вверх. Если используются юстировочные отверстия, удалите их из последующих слоев с помощью ручного инструмента для дырокола. Снимите защитную пленку с обратной стороны фиксирующего слоя, чтобы обнажить клей.

Выровняйте захватывающий слой над промывочным слоем, используя выравнивающие отверстия в качестве ориентира, затем прижмите два слоя друг к другу и избегайте прикосновения к гидрофильным зонам, чтобы свести к минимуму загрязнение или повреждение устройства. После этого снимите защитную пленку с обратной стороны инкубационного слоя, чтобы обнажить клей. Выровняйте инкубационный слой над захватывающим слоем и прижмите их друг к другу.

Продолжайте добавлять слои таким образом, пока все активные слои не будут собраны. Теперь поместите частично собранное устройство в защитный клин и прочно скрепите слои вместе с помощью ламинатора. Снимите защитную пленку с обратной стороны слоя для стирки и прикрепите слой кляксы к нижней части устройства.

После ламинирования для завершения сборки трехмерного микрофлюидного устройства на бумажной основе вырежьте с помощью ножниц из листов полностью собранных устройств нужное количество устройств. Добавьте 20 микролитров положительного контрольного образца буфера ХГЧ в гидрофильную зону в верхней части устройства. Как только образец полностью впитается в устройство, добавьте 15 микролитров промывочного буфера.

После того, как первая аликвота буфера для стирки полностью впитается в устройство, добавьте вторую 15 микролитров буфера для стирки. Чтобы получить результаты анализа, снимите три верхних слоя устройства с помощью пинцета, чтобы обнажить захватывающий слой. Метод печати воском может быть использован для формирования гидрофобных барьеров в микрофлюидных устройствах на основе бумаги и позволяет создавать жидкостные пути с воспроизводимыми размерами, что имеет решающее значение для анализов с повторяемыми характеристиками и временем продолжительности.

Эффективность бумажного иммуноферментного анализа ХГЧ была продемонстрирована путем параллельного проведения 35 положительных и 35 отрицательных анализов. Коэффициент вариации для каждого набора данных был определен равным 1% для анализов, выполненных с использованием отрицательных образцов, и 3% для анализов, выполненных с использованием положительных образцов. Смещение между слоями, содержащими инкубационный канал и зону захвата, может привести к развитию неравномерного характера положительного сигнала, что может привести к неправильной интерпретации качественного сигнала.

Если воск не напечатан в достаточном количестве или не дать ему полностью расплавиться по толще бумаги, то целостность образующихся гидрофобных барьеров может быть нарушена и привести к утечкам внутри устройства. Анализы, которые занимают больше времени, чем ожидалось, могут указывать на неисправность в изготовлении устройства. Микрофлюидные устройства на бумажной основе предоставляют исследователям универсальную платформу для разработки недорогих аналитических тестов на месте оказания медицинской помощи.

Несмотря на то, что существует ряд приложений, подход, который мы демонстрируем здесь, приводит к созданию общей архитектуры устройства для проведения иммунологических анализов, которые имеют решающее значение в здравоохранении. Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить о проверке на наличие дефектов в процессе изготовления и перед обработкой слоев дорогостоящими биохимическими реактивами. После освоения этот метод, от печати слоев до сборки обработанных слоев, может быть использован для подготовки листа функциональных иммунологических анализов за два часа.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изготавливать трехмерные устройства на бумажной основе, и чувствовать себя достаточно комфортно, чтобы адаптировать эту платформу к другим типам анализа.