Изготовление Трехмерная бумаги на основе микрожидком Устройства для иммуноанализа

Общая цель данного протокола — продемонстрировать наш процесс изготовления трехмерных устройств на бумажной основе, которые мы используем в качестве платформы для разработки экспресс-иммуноанализов. Этот метод предоставляет бумажную микрофлюидную платформу с надежным процессом производства, что позволяет направить время и усилия на разработку самих анализов, а не на проектирование устройств. Основным преимуществом нашего метода является возможность параллельного изготовления большого количества устройств, что востребовано в академических исследовательских проектах.

Как правило, новым пользователям будет сложно освоить этот метод, так как при изготовлении устройств необходимо учитывать множество переменных, таких как правильное совмещение слоев. Ошибки могут привести к неисправности устройств. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку процесс сборки трудно представить, опираясь только на сведения, приведенные в рукописях.

Сначала подготовьте слои качественной фильтровальной бумаги, вырезав из стандартного листа бумаги фрагмент подходящего размера для последующего нанесения рисунка с помощью воскового принтера. Поместите вырезанный лист бумаги в лоток принтера. Затем распечатайте заранее разработанные слои.

Затем с помощью настольного резака разрежьте стандартный рулон нейлоновой мембраны на листы, соблюдая крайнюю осторожность при работе с мембраной, чтобы сохранить ее целостность и предотвратить разрывы. Храните неиспользованный материал в эксикаторном шкафу, так как нейлоновые мембраны чувствительны к влаге. С помощью воскового принтера распечатайте шаблон захватывающего слоя на листе обычной бумаги и закрепите его скотчем на лайтбоксе, чтобы использовать в качестве ориентира при позиционировании нейлоновой мембраны.

После этого положите чистый лист копировальной бумаги поверх ранее распечатанного листа. Приклейте чистый лист бумаги к лайтбоксу скотчем, но не склеивайте два листа между собой. Теперь поместите вырезанный фрагмент нейлоновой мембраны на чистый лист копировальной бумаги, убедившись, что мембрана закрывает область печати на нижнем слое копировальной бумаги.

Приклейте все четыре стороны нейлоновой мембраны к чистому листу копировальной бумаги. Поместите лист нейлоновой мембраны, закрепленный на бумаге, в лоток ручной подачи принтера. Затем распечатывайте по одному листу нейлоновой мембраны за раз.

Прикрепите распечатанные слои к акриловой рамке с помощью ленты для обеспечения равномерного нагрева слоя сверху и снизу при помещении в печь с естественной конвекцией. Поместите слои в печь при температуре 150 °C на 30 секунд, пока воск не пропитает толщу бумаги. После извлечения бумаги из печи убедитесь, что воск просочился сквозь всю толщину бумаги, перевернув ее и проверив дизайн на наличие дефектов.

Извлеките бумажную и нейлоновую мембраны из акриловой рамки. Затем отделите нейлоновую мембрану от поддерживающего листа копировальной бумаги с помощью резака. Вырежьте шаблоны из двусторонних листов адгезивной пленки с помощью роботизированного плоттера с использованием заранее подготовленных файлов проекта.

После этого прикрепите с помощью скотча слой бумаги с выкройкой, который необходимо покрыть адгезивом, к лайтбоксу напечатанной стороной вниз. Отделите одну сторону защитного слоя от листа адгезива с выкройкой. Плотно прижмите лист адгезива с выкройкой и слой бумаги друг к другу.

Затем поместите частично собранное устройство в защитный чехол. После этого пропустите полученную двухслойную сборку через автоматический ламинатор, чтобы плотно прижать клей и бумагу друг к другу, удалив все воздушные полости между состыкованными слоями. Прикрепите слой конъюгата к акриловой рамке с помощью скотча таким образом, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона была подвешена и не соприкасалась с рамкой.

Добавьте 2,5 µL BSA и 1X PBS в гидрофильную зону конъюгационного слоя. После высушивания образца при комнатной температуре в течение двух минут высушите его при 65 °C в течение пяти минут. Затем добавьте 5 µL коллоидного золотого наночастиц с оптической плотностью 5 OD, конъюгированных с антителом к бета-hCG, после чего повторите процесс высушивания.

Прикрепите слой бокового канала к акриловой рамке с помощью клейкой ленты так, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона была подвешена и не касалась рамки. Добавьте 10 µL блокирующего агента для обработки бокового канала, затем повторите тот же процесс сушки, который использовался для конъюгационного слоя. Далее прикрепите слой захвата к акриловой рамке с помощью клейкой ленты так, чтобы обрабатываемая гидрофильная зона была подвешена и не касалась рамки.

Обработайте захватывающий слой, нанеся 5 µL антител к α-hCG. После высушивания образца при комнатной температуре в течение двух минут высушите его при 65 °C в течение восьми минут. Добавьте 2 µL блокирующего агента, затем повторите тот же процесс высушивания, который использовался для захватывающего слоя.

Приклейте промывочный слой к световому боксу так, чтобы сторона с рисунком была направлена вверх. Если используются отверстия для совмещения, удалите их из последующих слоев с помощью ручного дырокола. Снимите защитную пленку с обратной стороны захватывающего слоя, чтобы открыть клейкий слой.

Совместите слой захвата над промывочным слоем, используя отверстия для выравнивания в качестве ориентира, затем прижмите два слоя друг к другу, избегая касания гидрофильных зон, чтобы минимизировать загрязнение или повреждение устройства. После этого снимите защитную пленку с обратной стороны инкубационного слоя, чтобы открыть клеевой слой. Совместите инкубационный слой над слоем захвата и прижмите их друг к другу.

Продолжайте добавлять слои таким же образом, пока не будут собраны все активные слои. Теперь поместите частично собранное устройство в защитный конверт и плотно зафиксируйте слои друг с другом с помощью ламинатора. Снимите защитную пленку с обратной стороны промывочного слоя и прикрепите слой для блоттинга к нижней части устройства.

После ламинирования для завершения сборки трехмерного бумажного микрофлюидного устройства вырежьте из листов полностью собранных устройств нужное количество экземпляров с помощью ножниц. Добавьте 20 µL образца положительного контроля буфера hCG в гидрофильную зону на верхней части устройства. После полного впитывания образца устройством добавьте 15 µL промывочного буфера.

После того как первая порция промывочного буфера полностью впитается в устройство, добавьте вторую порцию промывочного буфера объемом 15 µL. Чтобы увидеть результаты анализа, с помощью пинцета снимите три верхних слоя устройства, чтобы открыть слой захвата. Метод восковой печати может быть использован для создания гидрофобных барьеров в бумажных микрофлюидных устройствах; он позволяет формировать жидкостные каналы с воспроизводимыми размерами, что крайне важно для обеспечения повторяемости результатов и времени проведения анализа.

Эффективность бумажного иммуноанализа на ХГЧ была подтверждена путем параллельного проведения 35 положительных и 35 отрицательных анализов. Коэффициент вариации для каждого набора данных составил 1% для анализов с использованием отрицательных образцов и 3% для анализов с использованием положительных образцов. Несоосность слоев, образующих инкубационный канал и зону захвата, может привести к возникновению неправильного рисунка положительного сигнала, что может вызвать неверную интерпретацию качественного сигнала.

Если воск напечатан в недостаточном количестве или ему не дали полностью расплавиться по всей толщине бумаги, целостность полученных гидрофобных барьеров может быть нарушена, что приведет к утечкам внутри устройства. Анализы, выполнение которых занимает больше времени, чем ожидалось, могут указывать на нарушение в процессе изготовления устройства. Бумажные микрофлюидные устройства предоставляют исследователям универсальную платформу для разработки недорогих аналитических тестов для диагностики в месте оказания медицинской помощи.

Несмотря на существование ряда применений, продемонстрированный нами подход позволяет создать общую архитектуру устройства для проведения иммуноанализов, которые имеют критическое значение для здравоохранения. При выполнении данной процедуры важно не забывать проверять наличие дефектов на этапе изготовления и перед обработкой слоев дорогостоящими биохимическими реагентами. После освоения этот метод — от печати слоев до сборки обработанных слоев — позволяет подготовить лист функциональных иммуноанализов за два часа.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготавливать трехмерные бумажные устройства, и уверенно адаптировать эту платформу для других интересующих вас типов анализов.