Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе лизатов отдельных клеток с помощью флуоресцентного или иммунологического анализа. Это достигается за счет создания сначала микрофлюидного устройства и покрытия внутренней камеры антителами. Затем отдельные клетки обездвиживаются в ловушках и подвергаются воздействию различных реагентов для стимуляции клеточного ответа на втором этапе.

Кольцевой клапан быстро закрывается, и через устройство проходит лизисный буфер. Кольцеобразный клапан открывается на короткое время, и клетки лизируются в микрокамере, что позволяет высвобожденным белкам связываться с антителами в высокой концентрации из-за небольшого объема. Затем открывается кольцевой клапан.

Камера промывается, а в закрытую микрокамеру вводятся реагенты для обнаружения. Увеличение интенсивности флуоресценции отслеживается с течением времени с помощью флуоресцентного микроскопа, результаты которого демонстрируют способность этой системы количественно и надежно обнаруживать представляющий интерес аналит, высвобождаемый из отдельных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области анализа одиночных А-клеток.

В частности, проводились систематические исследования клеточной реакции на изменения в химической среде. Мы можем видеть вверх или вниз регуляцию внутриклеточных молекул в результате химического стимула. Можно выделить два основных преимущества этой методики.

Первый заключается в том, что мы можем подвергать иммобилизованные клетки воздействию определенной химической среды, которая является постоянной или периодически изменяющейся. Во-вторых, мы можем реформировать высокочувствительный и специфичный анализ состояния без перекрестного загрязнения или потери аналитов из-за транспортировки. Для начала изготовьте три различные мастер-пластины SU eight, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Один из них будет использоваться для создания жидкостного слоя, другой — для контрольного слоя, а третий — для микроконтактного штампа. Затем изготовьте микрофлюидные чипы, начиная с приготовления смеси PDMS и отвердителя в соотношении 10 к одному. Энергично перемешайте обе части и дегазируйте раствор в течение 30 минут или пока смесь не избавится от пузырьков.

Затем поместите пластину в контрольный слой внутрь чашки Петри и прикрепите ее к дну. Насыпьте сверху примерно 50 граммов PDMS, чтобы создать слой толщиной от четырех до пяти миллиметров, и поместите пластину не менее чем на два часа в духовку при температуре 80 градусов Цельсия, чтобы обеспечить полное отверждение PDMS. Повторите ту же процедуру для пластины для микроконтактной печати, но используйте примерно 20 граммов PDMS вместо 50, в результате чего слой PDMS толщиной от четырех до пяти миллиметров.

Чтобы приготовить нижний слой, нанесите слой PDMS высотой 40 микрон на пластину с микрофлюидным слоем. При использовании частоты вращения 2000 об/мин в течение 60 секунд. Высушите слой PDMS в духовке в течение часа при температуре 80 градусов Цельсия, когда все детали затвердеют.

Снимите контрольный слой с и разрежьте его на кусочки с помощью бритвенного лезвия. Затем пробиваем отверстия под давлением с помощью прокола биопсии в один миллиметр и закрываем каналы лентой для хранения. Затем снимите PDMS с микроконтактной печатной пластины и подготовьте штампы размером с площадь камеры.

Храните их без пыли в ящике до использования. Затем поместите пластину с спиновым покрытием и контрольный слой толщиной от четырех до пяти миллиметров в плазменный очиститель. Экспонируйте детали на 18 Вт в течение 45 секунд с помощью кислородной плазмы при давлении 0,75 миллибар.

После плазменной обработки быстро выровняйте оба слоя под микроскопом с большим рабочим расстоянием. Добавьте несколько запасных PDMS вокруг установленных верхних частей, чтобы облегчить извлечение PDMS из пластины. Затем поместите в духовку при температуре 80 градусов Цельсия не менее чем на один час.

После отверждения с помощью скальпеля осторожно удалите PDMS из пластины и вырежьте микрочипы, пробивите отверстия для доступа к жидкостным соединениям с помощью биопсии на 1,5 миллиметра. Кроме того, создайте резервуар в микрочипе, разрезав верхнюю часть наконечника пипетки объемом 200 микролитров и используя запасной полуотвержденный PDMS. Приклейте его сверху.

Затем высушите чипсы в духовке при температуре 80 градусов Цельсия не менее одного часа. Начните с очистки предметного стекла и деталей PDMS. Очистите предметное стекло с мылом.

Промойте его дистиллированной водой, а затем еще раз этанолом. Высушите предметное стекло с помощью струи азота. Используйте ленту для удаления мусора и частиц пыли из PDMS.

Затем поместите часть PDMS и очищенное стекло. Вставьте в плазменный очиститель на 45 секунд при мощности 18 Вт, чтобы обеспечить плотное соединение, поместите чип на горячую плиту на пять минут после плазменной обработки После склеивания отрежьте нижнюю часть от нескольких наконечников пипетки объемом 200 микролитров. Наполните их от 10 до 15 микролитрами отфильтрованного PBS с 4% BSA и поместите их во входные отверстия устройства.

Затем используйте срезанные кончики с добавлением от 10 до 15 микролитров PBS и поместите их в контрольные каналы. Затем поместите чипсы в центрифугу и вращайте их со скоростью, в 800 раз превышающей силу тяжести, в течение пяти минут, чтобы заполнить каналы жидкостью. Если в каком-либо из каналов остался воздух, повторяйте этот шаг до полного заполнения каналов.

Инкубируйте раствор для блокировки не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем смойте раствор из слоя жидкости с помощью PBS со скоростью потока 10 микролитров в минуту. Используя шприцевой насос, устройство теперь готово к клеточным экспериментам: для предварительной печати стекла для иммунологических анализов инкубации микроконтактных печатных марок PDMS с 0,5% биотинилированного BSA в чистой чашке Петри.

Через полчаса тщательно и быстро очистите штампы дистиллированной водой и высушите штамп под струей азота. После высыхания быстро поместите штампы на очищенное предметное стекло, чтобы нанести узорчатый биотинилированный BSA. Не перемещайте штамп после установки и убедитесь, что штамп соприкасается со стеклоподъемником.

Если не слегка, коснитесь штампа, но не надавливайте сильно. Затем поместите штамп вместе с верхней частью микрофлюидного чипа в плазменную камеру и подвергните их воздействию кислородной плазмы мощностью 18 Вт в течение 45 секунд. После плазменной обработки снимите штамп со стекла

Дыхание на поверхности сделает узор видимым. Выровняйте микрокамеры поверх напечатанной поверхности. После выравнивания поместите чип на горячую плиту при температуре 50 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы заблокировать оставшуюся поверхность, введите 4% стерильный отфильтрованный раствор BSA в PBS в чип с помощью центрифуги, как показано ранее, инкубируйте микрочип в течение не менее 30 минут, а затем смойте раствор из слоя жидкости с помощью PBS со скоростью потока 10 микролитров в минуту.

Используя шприцевой насос, используйте чип непосредственно или храните его до двух недель при температуре четыре градуса Цельсия во влажной коробке. Затем создайте полнофункциональную связующую поверхность, введя в резервуар авадон в PBS. Влейте раствор, чтобы после этого провести авадон по жидкостным каналам.

Тщательно промойте резервуар и промойте каналы PBS. Затем добавьте в резервуар белок G и протяните его по каналам. Промойте избыток белка G, промыв резервуар и чипс PBS.

Далее добавьте интересующее антитело в резервуар и пропустите его по каналам. Затем остановите поток, чтобы обеспечить переплет перед промывкой каналов PBS флуоресцентно, можно использовать маркированные аналоги для проверки качества процесса печати перед введением ячеек в каналы. Соберите прилипшие клетки, такие как показанные здесь клетки HE 2 9 3, используя буфер для диссоциации без ферментов, а затем отфильтруйте их, чтобы уменьшить количество кластеров клеток после фильтрации, загрузите их в шприц.

При давлении 300 000 клеток на миллилитр загрузите элементы в чип с помощью прямого потока на шприцевом насосе в течение примерно трех минут со скоростью от 10 до 20 микролитров в минуту для адгезивных элементов, подобных этим, чтобы предотвратить неспецифическое прикрепление клеток при заполнении ловушек, закройте камеры, нагнетая давление в верхний слой тремя стержнями. Затем осмотрите камеры с помощью микроскопа. Если обнаружено, что многие клетки неспецифически прилипли к поверхности внутри камер, быстро откройте их и попытайтесь смыть их буфером для диссоциации клеток со скоростью потока от 10 до 30 микролитров в минуту.

Для анализа глюкозо-шестифосфатдегидрогеназы или G 6-ПДГ добавьте в буфер для лизиса два миллимоляра глюкозы, шесть фосфатов 0,5 миллимоляра и массив DIA с концентрацией DP 0,5 единицы на миллилитр и 0,3 миллимолярного RIN и убедитесь, что он хорошо перемешан. После того, как каналы будут очищены, проведите буфер для лизиса G six PDH через чип со скоростью потока 30 микролитров в минуту. По мере того, как буфер для лизиса течет, быстро открывайте и закрывайте камеры, оставляя их открытыми на 500 миллисекунд, чтобы позволить лизису войти в камеру сразу после того, как лизис начнет контролировать кинетическую реакцию.

В этом примере флуоресцентный продукт можно контролировать с течением времени. Здесь показан массив камер, которые были заполнены оранжевым пищевым красителем, а затем закрыты путем создания давления в контрольном слое над микрокамерами. После закрытия камеры зеленый пищевой краситель промывался через каналы, чтобы показать герметичность камер

Каждая камера содержит объем всего 625 пиколитров жидкости, что поддерживает концентрацию молекул, высвобождаемых из клеток лиса, достаточно высокой для анализа. Кроме того, клапаны можно открывать и закрывать таким образом, чтобы исключить перекрестное загрязнение между камерами. В этих камерах можно измерить аналиты, такие как количество лизосомы, высвобождаемой из одной активированной PMA клетки U 9 37, поскольку она ферментативно катализирует производство флуоресцентной молекулы в камере.

Зелеными линиями обозначено изменение интенсивности флуоресценции с течением времени для камер, занимаемых одной ячейкой. Также показана интенсивность флуоресценции для камеры без ячеек, представленная черной пунктирной линией. Для сравнения, этот анализ показывает влияние токсичной молекулы на целостность мембраны путем измерения внутриклеточного фермента G six PDH.

Черная линия представляет контрольные образцы без токсического воздействия, тогда как оранжевая линия представляет клетки, подверженные воздействию показанного токсина. Вот пример иммунологического анализа на внутриклеточный белок. Антитела GFP anti GFP были иммобилизованы на поверхности, и после лизиса клеток кинетика связывания белков GFP была визуализирована с помощью микроскопии.

Время 0,1 отмечает введение буфера для лизиса, в момент времени 0,2 GFP начинает накапливаться на поверхности, что означает, что произошел лизис клеток и GFP диффундировал на поверхность. Связывание GFP с антителами завершается в момент времени 0,3. В этом последнем примере высвобожденный GA DH связывался с антителами на поверхности, а затем добавлялись антитела, связанные с HRP.

После того, как все несвязанные антитела для обнаружения были смыты, был введен реагент для обнаружения, и реакция закончилась. Ниже приведено сравнение количества ранее внутриклеточного GA DH в животных количествах между клетками U 9 37 и HEC 2 93, измеренным с помощью этого метода. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить микрофлюидные чипы, как модифицировать поверхность для проведения иммунологических анализов и, наконец, как использовать устройство для анализа отдельных клеток.

Этот метод может быть использован для того, чтобы помочь ответить на многие вопросы в области биологии одиночных клеток.