Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе лизатов единичных клеток с помощью флуоресцентного анализа или иммуноанализа. Для этого сначала создается микрофлюидное устройство, и внутренняя камера покрывается антителами. Затем единичные клетки иммобилизируются в ловушках и на втором этапе подвергаются воздействию различных реагентов для стимуляции клеточного ответа.

Кольцевой клапан быстро закрывают, и через устройство пропускают лизирующий буфер. Затем кольцевой клапан открывают на короткое время; клетки лизируются внутри микрокамеры, что позволяет высвобожденным белкам связываться с антителами при высокой концентрации за счет малого объема. После этого кольцевой клапан открывают.

Камеру промывают, и в закрытую микрокамеру вводят реагенты для детекции. Прирост интенсивности флуоресценции отслеживают с течением времени с помощью флуоресцентного микроскопа; результаты демонстрируют способность данной системы количественно и достоверно детектировать интересующий аналит, высвобождаемый отдельными клетками. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области анализа одиночных клеток.

В частности, были проведены систематические исследования клеточного ответа на изменения химической среды. Мы можем наблюдать повышение или снижение экспрессии внутриклеточных молекул в результате химического стимула. Данный метод имеет два основных преимущества.

Во-первых, это позволяет подвергать иммобилизованные клетки воздействию определенной химической среды, которая может оставаться постоянной или периодически изменяться. Во-вторых, мы можем проводить высокочувствительный и специфический анализ состояния без перекрестного загрязнения или потери аналитов при транспортировке. Для начала изготовьте три различные мастер-пластины из SU 8, как описано в сопровождающем текстовом протоколе.

Одна часть будет использоваться для создания флюидного слоя, вторая — для управляющего слоя, а третья — для микроконтактного штампа. Затем приступите к изготовлению микрофлюидных чипов, начав с приготовления смеси PDMS и отвердителя в соотношении 10:1. Тщательно перемешайте обе части и удалите пузырьки воздуха из раствора путем дегазации в течение 30 минут или до полного исчезновения пузырьков в смеси.

Затем поместите подложку с контрольным слоем в чашку Петри и закрепите ее скотчем к дну. Налейте сверху примерно 50 грамм PDMS, чтобы создать слой толщиной от четырех до пяти миллиметров, и поместите подложку в печь при 80 °C минимум на два часа для полного отверждения PDMS. Повторите ту же процедуру для подложки для микроконтактной печати, используя примерно 20 грамм PDMS вместо 50, чтобы получить слой PDMS толщиной от четырех до пяти миллиметров.

Для подготовки нижнего слоя нанесите методом центрифугирования слой PDMS толщиной 40 микрон на пластину с микрофлюидным слоем. Используйте скорость вращения 2000 RPM в течение 60 секунд. После отверждения всех компонентов подвергните слой PDMS термообработке в печи в течение одного часа при 80 °C.

Удалите управляющий слой с пластины и разрежьте её на части с помощью лезвия бритвы. Затем с помощью биопсийного пункциона диаметром 1 мм проколите отверстия для подключения давления и закройте каналы лентой для хранения. После этого снимите PDMS с пластины для микроконтактной печати и подготовьте штампы, размер которых соответствует площади камеры.

Храните их в выдвижном ящике, защищенном от пыли, до момента использования. Затем поместите подложку с нанесенным методом центрифугирования слоем и контрольный слой толщиной четыре-пять миллиметров в установку для плазменной очистки. Обработайте образцы кислородной плазмой при давлении 0,75 millibar и мощности 18 watts в течение 45 секунд.

После обработки плазмой быстро совместите оба слоя под микроскопом с большим рабочим расстоянием. Добавьте немного дополнительного PDMS вокруг установленных верхних частей, чтобы облегчить последующее удаление PDMS с пластины. Затем поместите пластину в печь при температуре 80 °C минимум на один час.

После отверждения с помощью скальпеля аккуратно отделите PDMS от подложки и вырежьте микрочипы; с помощью биопсийного пробойника диаметром 1,5 millimeter пробейте отверстия для подключения жидкостных линий. Кроме того, создайте резервуар в микрочипе, отрезав верхнюю часть наконечника пипетки объемом 200 microliter и используя небольшое количество полуотвержденного PDMS. Приклейте его сверху.

Затем отвердите чип в печи при 80 °C в течение не менее одного часа. Начните с очистки предметного стекла и деталей из PDMS. Очистите предметное стекло с помощью мыльного раствора.

Промойте его дистиллированной водой, затем снова этанолом. Высушите предметное стекло струей азота. С помощью клейкой ленты удалите с PDMS любые частицы мусора и пыли.

Затем поместите деталь из PDMS и очищенное стекло в установку для плазменной очистки на 45 секунд при мощности 18 Вт для обеспечения прочного соединения. После плазменной обработки поместите чип на нагревательную платформу на пять минут. После склеивания срежьте нижнюю часть у нескольких наконечников для пипеток объемом 200 µL. Заполните их 10–15 µL фильтрованного PBS с 4% BSA и установите их во входные отверстия устройства.

Затем используйте обрезанные наконечники, в которые добавлено от 10 до 15 µL PBS, и введите их в контрольные каналы. После этого поместите чипы в центрифугу и центрифугируйте при 800 ×g в течение пяти минут, чтобы заполнить каналы жидкостью. Если в каком-либо из каналов остался воздух, повторяйте этот шаг до полного заполнения каналов.

Инкубируйте блокирующий раствор в течение не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем промойте жидкостный слой раствором PBS со скоростью потока 10 µL в минуту. Используя шприцевой насос, подготовьте устройство к экспериментам с клетками; для предварительной подготовки стеклянного предметного стекла для иммуноанализов инкубируйте штампы для микроконтактной печати из PDMS с 0,5% биотинилированным BSA в чистой чашке Петри.

Через полчаса тщательно и быстро промойте штампы дистиллированной водой и высушите их потоком азота. После высыхания быстро перенесите штампы на очищенный предметное стекло для осаждения структурированного биотинилированного BSA. Не перемещайте штамп после установки и убедитесь, что штамп плотно прилегает к предметному стеклу.

Если штамп прилегает недостаточно плотно, слегка постучите по нему, не нажимая слишком сильно. Затем поместите штамп вместе с верхней частью микрофлюидного чипа в плазменную камеру и подвергните воздействию кислородной плазмы при мощности 18 ватт в течение 45 секунд. После плазменной обработки снимите штамп со стеклянного предметного стекла.

Дыхание на поверхность сделает паттерн видимым. Совместите микрокамеры с напечатанной поверхностью. После совмещения поместите чип на нагревательную платформу при температуре 50 °C на 30 минут, чтобы заблокировать оставшуюся поверхность, введите в чип 4% стерильно фильтрованный раствор BSA в PBS с помощью центрифуги, как было показано ранее, инкубируйте микрочип не менее 30 минут, а затем промойте жидкостной слой раствором PBS со скоростью потока 10 µL в минуту.

Используя шприцевой насос, используйте чип непосредственно или после хранения при температуре four degrees celsius в увлажненном боксе в течение периода до двух недель. Затем создайте полностью функциональную связывающую поверхность, введя avadon в PBS в резервуар. После этого пропустите раствор, чтобы переместить avadon через жидкостные каналы.

Тщательно промойте резервуар и промойте каналы с помощью PBS. Затем добавьте белок G в резервуар и пропустите его через каналы. Удалите излишки белка G, промыв резервуар и чип раствором PBS.

Затем добавьте интересующие вас антитела в резервуар и пропустите их через каналы. После этого остановите поток, чтобы обеспечить связывание, а затем промойте каналы раствором PBS; для проверки качества процесса печати перед введением клеток в каналы можно использовать флуоресцентно меченые аналоги. Соберите адгезивные клетки, такие как клетки HE 2 9 3, показанные здесь, используя буфер для диссоциации без ферментов, и отфильтруйте их для уменьшения количества клеточных кластеров; после фильтрации перенесите их в шприц.

При концентрации 300 000 клеток на миллилитр загрузите клетки в чип, используя прямой поток шприцевого насоса в течение примерно трех минут со скоростью от 10 до 20 µL в минуту; для таких адгезивных клеток это необходимо, чтобы предотвратить неспецифическое прикрепление клеток при заполнении ловушек. Закройте камеры, создав давление три бара в верхнем слое. Затем осмотрите камеры под микроскопом. Если обнаружится, что многие клетки неспецифически прикрепились к поверхности внутри камер, быстро откройте их и попытайтесь вымыть клетки буфером для диссоциации клеток при скорости потока от 10 до 30 µL в минуту.

Для проведения анализа глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PDH) добавьте в лизирующий буфер 2 мM глюкозо-6-фосфата, 0,5 мM NADP, 0,5 ед/мл G6PDH и 0,3 мM рибофлавина, после чего тщательно перемешайте смесь. Когда каналы будут очищены, прокачайте лизирующий буфер G6PDH через чип со скоростью потока 30 µL/мин. Во время подачи буфера быстро откройте и закройте камеры, оставив их открытыми на 500 мс, чтобы лизизат попал в камеру, и сразу после начала лизиса приступайте к мониторингу кинетики реакции.

В данном примере можно наблюдать за флуоресцентным продуктом в динамике. Здесь представлен массив камер, которые были заполнены оранжевым пищевым красителем, а затем перекрыты путем подачи давления в управляющий слой над микрокамерами. После закрытия камер через каналы был промыт зеленый пищевой краситель, чтобы продемонстрировать герметичность камер.

Каждая камера содержит лишь 625 пиколитров жидкости, что позволяет поддерживать концентрацию молекул, высвобождаемых из лизис-клеток, на уровне, достаточном для анализа. Кроме того, клапаны можно открывать и закрывать таким образом, чтобы исключить перекрестное загрязнение между камерами. В этих камерах можно измерять такие аналиты, как количество лизосом, высвобожденных одной PMA-активированной клеткой U 9 37, поскольку они ферментативно катализируют выработку флуоресцентной молекулы внутри камеры.

Зеленые линии представляют изменение интенсивности флуоресценции с течением времени для камер, в которых находится одна клетка. Также пунктирной черной линией показана интенсивность флуоресценции для камеры без клеток. Для сравнения в данном анализе показано влияние токсичной молекулы на целостность мембраны путем измерения активности внутриклеточного фермента G six PDH.

Черная линия представляет контрольные образцы без токсического воздействия, в то время как оранжевая линия представляет клетки под воздействием указанного токсина. Ниже приведен пример иммуноанализа для внутриклеточного белка. Антитела GFP anti GFP были иммобилизованы на поверхности, и после лизиса клеток кинетика связывания белков GFP была визуализирована с помощью TIRF-микроскопии.

Отметка времени 0,1 соответствует моменту добавления буфера для лизиса; к моменту 0,2 GFP начинает накапливаться на поверхности, что свидетельствует о произошедшем лизисе клеток и диффузии GFP к поверхности. Связывание GFP с антителами завершается к моменту 0,3. В этом заключительном примере высвобожденный GA DH связался с захватывающими антителами на поверхности, после чего были добавлены детектирующие антитела, конъюгированные с HRP.

После того как все несвязанные антитела для детекции были удалены путем промывки, вводился детектирующий реагент, и реакция протекала в течение определенного времени. Ниже приведено сравнение количества ранее внутриклеточного GA DH в животных образцах клеток U 9 37 и HEC 2 93, измеренное с помощью данного метода. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать микрофлюидные чипы, как модифицировать поверхность для проведения иммуноанализов и, наконец, как использовать устройство для анализа единичных клеток.

Этот метод может быть использован для поиска ответов на многие актуальные вопросы в области биологии одной клетки.