Два Алгоритмы высокой пропускной способности и мульти-параметрической Количественное Drosophila Нейромышечная Junction Морфология

Общая цель этой процедуры заключается в автоматической количественной оценке морфологических особенностей нервно-мышечного перехода дрозофилы с помощью морфометрических программных макросов. Этот метод может помочь выявить регуляторы развития синапсов, что является ключевым вопросом в нейробиологии. Основным преимуществом этого метода является автоматическая количественная оценка нескольких признаков NMJ.

Это позволяет проводить объективный анализ морфологии NMJ в высоких сквозных условиях. Мы решили разработать эту методологию, чтобы иметь возможность исследовать морфологию NMJ на большом количестве моделей заболеваний. Мы думали о том, как предотвратить их личные различия и как значительно ускорить процесс количественной оценки.

Наглядная демонстрация этого метода очень полезна. Соответствующие настройки макросов имеют решающее значение, и некоторые шаги могут быть сложными для новых пользователей, особенно если они не знакомы с программным обеспечением VT. Для этого протокола генерируйте стеки изображений NMJ и сохраняйте их в виде отдельных файлов TIFF, где первый канал показывает окрашивание DLG1 или аналогичный маркер, а второй канал показывает окрашивание BRP.

Для начала создайте проекции C и гиперстеки файлов изображений NMJ. Откройте параметры плагина и выберите Drosophila NMJ Morphometrics. Теперь определите уникальную строку файла, которую микроскоп присвоил серии изображений при их хранении в формате TIFF.

Это будет в конце имени изображения. Скопируйте и вставьте заданную строку до самой низкой плоскости и номера канала в уникальное окно настройки строки файла. Затем выберите подмакрос convert to stack и выберите каталог или папку, в которой находятся изображения.

Для каждого файла изображения создаются два новых файла с именами по умолчанию stack и flat stack, за которыми следует исходное имя изображения. Затем исходные файлы можно удалить, чтобы сэкономить место на диске. Затем в интерфейсе Drosophila NMJ Morphometrics выберите подмакрос define ROI и выберите каталог файла изображения.

Когда откроется первая проекция, выберите инструмент произвольного выделения. Затем с помощью мыши определите область, содержащую полный интересующий терминал NMJ. После выбора нажмите OK в окне определения терминала.

Продолжайте делать это до тех пор, пока терминалы NMJ не будут определены во всех проекциях. Макрос автоматически продвигает процесс. Для каждого файла изображения создается один новый файл с именами по умолчанию, ROI, за которыми следует исходное имя изображения.

Чтобы количественно оценить признаки NMJ, сначала перейдите в интерфейс Drosophila NMJ Morphometrics и установите масштаб. Например, если один пиксель на изображении соответствует 0,72 мкм, установите масштаб пикселей равным единице, а масштабное расстояние равным 0,072. Затем выберите подмакрос анализа и, если есть два канальных изображения, также переключите вес.

Нажмите OK и при появлении запроса выберите каталог файла изображения. Время обработки может составлять несколько минут на один синапс. После анализа новые файлы изображений для каждого анализируемого синапса сохраняются в родительской папке, а результатом являются количественные измерения.

txt файл. Проверьте все изображения и исключите изображения с ошибками сегментации. Например, части синаптической окончания могут не быть включены в желтый контур.

Части фона могут быть включены в синаптическую окончание. Синяя скелетная линия может выходить за пределы синаптической окончании. Активных зон может быть слишком много, или некоторые активные зоны могут остаться незамеченными.

Если более 5% изображений имеют ошибки сегментации, изучите различные алгоритмы анализа для улучшения обработки изображений. В следующих разделах видео описывается, как определить многие из этих параметров макроанализа. Чтобы настроить значение радиуса катящегося шарика для макроса, выберите три проекции NMJ Z, которые являются репрезентативными для набора данных изображения.

Удалите имя образа результирующего разрешения и имя образа стека двух активных зон, ранее созданные подмакросом analyze. Откройте файлы имен изображений стека для каждого выбранного изображения, а затем на панели инструментов выберите разделенные каналы, чтобы создать изображение первого канала и изображение второго канала, и сохраните эти файлы. Откройте изображение, относящееся к первому каналу, который в данном случае соответствует иммуномаркировке DLG one.

Теперь запустите фильтр вычитания фона, который находится на вкладке процесса. Установите радиус катящегося шара на значение, которое увеличивает контраст между синапсом и фоном. Создайте Z-проекцию с типом проекции в качестве максимальной интенсивности и сохраните изображение.

Затем запустите алгоритм вычитания фона с новым радиусом катящегося шара на всех проекциях Z и сохраните результаты. Чтобы определить наилучшие автоматические пороговые значения для макроса, откройте сохраненные проекции C и запустите автоматический порог с параметром try all. На основе полученных изображений найдите наиболее подходящий алгоритм для изображений и продолжайте использовать этот пороговый параметр при запуске макроса для дальнейших изображений.

Определение различных автоматических пороговых значений имеет решающее значение для правильной сегментации изображения по макросу. По этой причине, чтобы правильно количественно оценить восемь параметров вывески, важно ознакомиться с 16 вариантами автоматического порога, предлагаемыми программным обеспечением. Нажмите кнопку с плюсом, чтобы увеличить результирующее изображение автоматического порога.

Имена алгоритмов расположены под каждым изображением результата. В этом примере лучшим алгоритмом автоматического порога для установки порога контура NMJ является Huang. Для скелетного порога лучшим значением является Li, а для порога активной зоны — Huang.

Чтобы определить точное значение допустимости шума для макроса, вернитесь к исходным репрезентативным NMJ-изображениям. Откройте канал BRP. Перейдите на вкладку плагинов во всплывающем меню и выберите максимум 3D.

Через некоторое время появится новое изображение, после чего закройте исходное изображение. Далее используйте минимальную 3D-команду. Затем закройте максимум C2 стеков синапса одним изображением и выберите только что созданное изображение минимум максимума C2 стека синапс один.

Теперь используйте команду find maxima. В открывшемся окне выберите выбор точки предварительного просмотра и установите допуск по шуму равным 50. Точки максимумов затем обозначаются маленькими крестиками, которые должны покрывать только активные зоны синапсов.

Если крестов сделано слишком много, увеличьте значение толерантности к шуму. Если некоторые из активных зон не аннотированы, уменьшите значение толерантности к шуму. Используйте производное пороговое значение для поля find maxima noise tolerance макроса.

При выборе максимального значения толерантности к шуму важно правильно количественно определить количество активных зон. Иногда необходимо попробовать разные значения, чтобы определить правильное. Теперь настройте все производные значения в алгоритмах пороговых значений в интерфейсе макроса и запустите анализ подмакроса на репрезентативных изображениях, которые изначально использовались для определения параметров макроса.

Будет создан новый файл с активными зонами, обозначенными белыми точками. Откройте этот файл, перетащив его на панель инструментов и выбрав проект Z с типом проекции в виде нескольких срезов. Таким образом, создается файл проекции.

Следующим шагом является корректировка порога. В новом окне порога проведите по верхней панели, чтобы выбрать пороговое значение, при котором считываются все нужные фокусы. Это положительные точки BRP.

Используйте это значение в качестве нижнего порога BRP puncta. Теперь повторите анализ на исходных репрезентативных изображениях NMJ, используя ранее определенные значения, алгоритмы, а затем новое нижнее пороговое значение BRP puncta. Полученные изображения должны соответствовать критериям критического анализа.

Теперь используйте настройки define для запуска макроса на всех NMJ-изображениях, полученных в тех же условиях. Макрометрика NMJ Drosophila была использована для валидации различных известных синаптических дефектов в трех мутантных генотипах. Известно, что у двух мутантов Анкирина есть слитые бутоны и меньшие NMJ.

С помощью макроса были измерены площадь и периметр пануронила и квирина, двух нокдаун-нокдаун NMJ, и было обнаружено, что они значительно меньше, чем в контроле. GTPase Rab3 требуется для правильного распределения bruckpila. При нарушении активных зон становится меньше.

При использовании макроса пануронила Rab 3 у сбитых мух было в среднем 138 активных зон на терминал NMJ по сравнению с 290 обнаруженными в контрольной группе. Высокий провод является важным регулятором роста NMJ, и когда они мутировали, NMJ имеют расширенное разветвление на своих выводах. Использование макропануронила с высоким содержанием проводов в линиях нокдауна показало значительное увеличение нескольких скелетных производных параметров в их NMJ, включая общую длину, длину самой длинной ветви, количество ветвей и количество точек ветвления.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как работать и настраивать параметры макроса морфометрии Drosophila NMJ. После освоения анализ 50 синапсов может быть выполнен в течение одного часа. Это экономит примерно 15 минут времени количественной оценки на синапс.

Важно получить изображения NMJ в хорошем качестве. Чем качественнее изображения, тем лучше будет работать макрос. Этот метод поможет исследователям в области нейробиологии эффективно количественно определять морфологические параметры NMJ дрозофилы.