Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на Drosophila Личиночная нейромышечных синапсах

Общая цель данной методологии — показать, как проводить количественный анализ анатомических признаков. Показана количественная оценка фенотипов, влияющих на морфологию, размер и положение ядер с поперечно-полосатой мускулатурой личинок дрозофилы. Понимание молекулярного механизма, контролирующего морфологию, размер и распределение внутриклеточных органелл, является одним из важнейших вопросов современной биологии.

В прошлом морфологические вариации между экспериментальными группами и внутри них подвергались только качественному анализу. Здесь мы предлагаем с помощью количественного анализа, сочетающего генетику дрозофилы с морфометрическим количественным анализом, идентифицировать гены, контролирующие размер, форму и распределение ядер в мышцах. Помогать с демонстрацией процедуры будет Лейре Ледахавски, аспирант моей лаборатории.

После вскрытия и окрашивания нервно-мышечных соединений личинок в соответствии с текстовым протоколом с помощью щипцов извлеките образцы из микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитра и положите их на предметное стекло. С помощью ножниц для микрорассечения отрежьте голову и хвост от филе и сохраните их внутренние поверхности вверху. Теперь подготовьте монтажную направляющую, обернув три полоски целлюлозной ленты вокруг чистой горки на расстоянии одного сантиметра друг от друга.

Положите крышку на этот предусмотренный зазор, чтобы он не сплющивал образцы. Затем нанесите около 20 микролитров монтажной среды между полосками целлюлозной ленты и распределите среду вокруг чистыми щипцами. Теперь удалите лишнюю салфетку из препса.

Перетащите расчлененных личинок с обрабатывающего предметного стекла на монтажное стекло и в монтажную среду, удерживая внутреннюю поверхность вверху. Затем аккуратно наложите защитный лист, стараясь не задерживать воздух. Затем запечатайте предметное стекло прозрачным лаком для ногтей и дайте предметному стеклу высохнуть не менее 10 минут перед визуализацией.

Для этого анализа используйте конфокальные изображения, показывающие мышцы стенки тела личинок, окрашенные антителами DeVAP, антителами к ламину и ядерным маркером. Затем перетащите изображения с конфокальным стеком Z на арену. Дважды щелкните по изображениям, чтобы автоматически открыть их в режиме просмотра Surpass, доступ к которому осуществляется с помощью значка на панели инструментов.

Вид Surpass имеет три основные панели рабочего пространства. Область просмотра, Список объектов и Свойства объекта. Затем нажмите на иконку 3D View, чтобы создать объемное изображение с трехканальной визуализацией.

Затем выберите «Добавить новые точки измерения» на панели инструментов «Объекты» и следуйте инструкциям мастера создания в области «Свойства объекта». Сначала выберите вкладку «Правка», а затем в разделе «Определенный канал» выберите либо ядерный маркер, либо ламинный канал, чтобы выделить ядра. Далее установите указатель в режим Выделение, нажав вкладку Escape, а затем отрегулируйте размер поля 3D курсора с помощью колеса мыши, чтобы оно содержало заданное ядро на изображении.

Добавьте точку измерения, удерживая клавишу Shift и щелкнув левой кнопкой мыши по тому же ядру. Затем добавьте вторую точку на соседнее ядро той же мышцы, используя ту же технику. Между двумя точками автоматически будет проведена линия, а расстояние между двумя ядрами будет отображено и записано в виде статистической переменной.

Повторите эту процедуру для всех ядер, окружающих данное ядро. Затем из всех собранных точек измерения, которые находятся в разделе «Подробные данные статистики о расстоянии», выберите кратчайшее расстояние. В области «Свойства объекта» выберите параметр «Экспорт статистики с доступной вкладкой «Отображение в файл».

При этом данные сохраняются в электронной таблице. Для этого анализа используйте конфокальные изображения мышц стенки тела, окрашенных ламином, и ядерный маркер для визуализации ядер. Чтобы оценить форму миоядер, измерьте их сферичность, которая сравнивает площадь поверхности ядра с площадью сферы с таким же объемом.

В качестве альтернативы измерьте эллиптичность, которая различает вытянутые, сплюснутые или эллипсоиды и сфероиды. Откройте изображение, как описано выше. Затем нажмите на иконку панели инструментов «Объекты» и выберите «Добавить новые поверхности».

В мастере создания, который появится в области «Свойства объекта», выберите окрашивание ядерного маркера в качестве исходного канала для отображения ядер. Установите опцию Абсолютная интенсивность в качестве порога. Убедитесь, что большинство ядер показывают плавный, не перегруженный рендеринг, изменяя значение на пороговой кривой.

При этом следует избегать наличия отверстий или неполных масок любых ядер. Затем используйте инструмент Фильтр для удаления шума при рендеринге поверхности. На вкладке «Редактирование» только что созданного слоя поверхности разделите поверхности ядер, которые были неправильно отрисованы.

Другой вариант — объединить поверхности ядер, которые были неправильно отрисованы. Значения эллиптичности и сферичности ядер, визуализированных на поверхности, доступны на вкладке Статистика. Экспортируйте эти данные для анализа.

Для этого протокола используйте конфокальные изображения, сообщающие о мышцах стенки тела, окрашенных ядерным маркером и антителами, специфичными к ламину и DeVAP. Откройте интересующее изображение в пункте Главного меню Редактировать, затем Обрезать 3D. Следуйте указаниям мастера создания поверхностей с помощью канала пластинки, как описано в предыдущем разделе.

Как только поверхность будет создана, нажмите «Редактировать» в области «Свойства объектов» и выберите «Маскировать все», чтобы изолировать сигнал внутри ядра. Далее выбираем сигнал DeVAP. В выпадающем меню Select Channel нажмите на опцию Set Voxels Outside the Surface и сделайте это значение нулевым.

При этом создается новый замаскированный канал, доступный в окне «Настройка отображения». Чтобы визуализировать наличие сигнала внутри ядра, создайте контурную плоскость, нажав на иконку «Добавить новую плоскость отсечения» на панели инструментов «Объекты». Затем интерактивно отрегулируйте угол плоскости клиппинга и ее положение, чтобы визуализировать распределение сигнала внутри ядра.

Миссенс-мутации в человеческом VAMP-ассоциированном белке B вовлечены в патогенез ALS. Используя описанный метод, поперечно-полосатые мышцы, экспрессирующие ген DeVAP мухи, содержащий мутацию V2601, вызывающую БАС, сравнивали с контрольной группой, экспрессирующей сопоставимые уровни DeVAP дикого типа или более высокие уровни DeVAP дикого типа. Для оценки распределения ядер вдоль мышечных волокон был использован анализ ближайших соседей.

По сравнению с контрольными мышцами, экспрессирующими мутировавший трансген DeVAP, или мышцами с избыточной экспрессией белка дикого типа, интересующая нас мутация вызвала резкое сокращение среднего кратчайшего расстояния между ядрами. Далее была исследована сферичность ядер. Было обнаружено, что трансгены, уменьшающие расстояние между ядрами, также увеличивают объем ядер.

3D-реконструкции и объемные рендеры ядер показали, что мышцы, экспрессирующие интересующую мутацию, образуют кластеры, которые локализованы в ядрах. Этот метод также может быть расширен до количественного анализа морфологических особенностей, связанных с другими органеллами, такими как митохондрии. Изменения в архитектуре, положении и размере ядра были связаны со старением и рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и БАС.

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе диспраксиса, может привести к выявлению новых фармакологических мишеней для эффективных терапевтических вмешательств.