Испарение снижающих культуры Состояние увеличивает Воспроизводимость многоклеточных сфероида образования в микротитрационных планшетах

Общая цель этой процедуры заключается в улучшении масштабируемости и воспроизводимости равномерного формирования сфероидов с использованием метода наложения жидкости в 384 луночных планшетах. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он снижает чрезмерную повторную операцию среды с нескольких пластин и, таким образом, улучшает воспроизводимость формирования сфероидов. Мы разработали и валидировали метод культивирования 3D-сфероидов для скрининговых тестов членистоногих в нашей лаборатории, и наше исследование было направлено на оценку краевого эффекта в пластинах многоклеточных культур.

Сегодня я продемонстрирую процедуру вместе с Соной, постером из лаборатории. Начните эту процедуру, взвесив ноль целых семь целых пять граммов агарозы с низкой температурой плавления и добавьте ее к 100 миллилитрам среды McCoy's 5a с феноловым красным или без него и без сыворотки. Нагрейте раствор в микроволновой печи и взбалтывайте его каждые одну-две минуты, чтобы полностью растворить агарозу.

Затем в автоклаве раствор простерилизовать его. После того, как автоклавная агароза остынет примерно до 70 градусов Цельсия, отфильтруйте ее через 500 миллилитровый фильтр с крышкой от нуля целых две десятых два микрометра в камере с ламинарным потоком. Далее, если сразу не будет использоваться весь раствор, аликвотируйте его.

Храните этот готовый к использованию раствор агарозы в асептическом виде в холодном помещении или холодильнике с температурой четыре градуса Цельсия до четырех недель. Работая в проточном боксе, установите в комби-дозатор дозатор пластиковую или металлическую кассету. Поместите груз трубки в сосуд с 70-процентным содержанием этанола, а затем загрунтуйте кассету.

Затем переместите груз трубки в сосуд PBS и снова заправьте его. Далее нагрейте в микроволновой печи накопленную аликвоту отфильтрованного раствора агарозы, чтобы она расплавилась. Загрунтуйте дозирующую кассету раствором агарозы, а затем начните протокол нанесения 384 лунки на микропланшеты, обработанные культурой тканей, 15 микролитрами отфильтрованного раствора агарозы.

Дайте агарозе в тарелке остыть в течение 15-20 минут, прежде чем засевать ячейки, как описано в следующем разделе видео, или хранить их при температуре четыре градуса Цельсия и вдали от прямых солнечных лучей. Наконец, чтобы очистить дозирующую кассету, поместите груз трубки в стерильную воду с температурой от 70 до 80 градусов Цельсия и нажмите кнопку заправки на дозаторе. Это удалит остатки агарозы в наконечниках кассеты и трубках.

Следующий процесс посева клеток следует проводить в стерильных условиях и в камере с ламинарным потоком. Начните с извлечения необходимого количества покрытых агарозой 384 лунок обработанных культурой тканей микропланшетов из холодильного хранилища и дайте им уравновеситься до комнатной температуры в течение 15 минут. Тем временем подготовьте дозатор комбинированных реагентов для обзора клеток, заправив стандартную дозирующую кассету пробиркой 70-процентным этанолом и стерильным PBS.

Далее, с помощью кнопок ручной настройки на диспенсере, отрегулируйте объем просмотра до необходимого микролитра и скорость выдачи до средней. Используйте фермент диссоциации рекомбинантных клеток для удаления адгезивных клеток колоректальной карциномы человека HCT116 из колбы для культуры тканей. В стерильный стакан вносят клеточный запас суспензии с клетками плотностью 2,5 умножить на 10 до 4 клеток на миллилитр на лунку в 50 микролитров полной питательной среды.

Если будет засеяно более одной пластины на 384 лунки, используйте магнитную мешалку, чтобы предотвратить их оседание на дно стакана. С помощью дозатора добавьте 25 сотен клеток в каждую лунку планшета на 384 лунки. Дайте тарелкам отдохнуть 30 минут при комнатной температуре.

Тем временем возьмите крышку микропланшета, уменьшающую испарение, и с помощью пятимиллилитровой пипетки нанесите четыре миллилитра пятипроцентного диметилсульфоксида в левое боковое желобо, медленно проводя вверх и вниз. Повторите этот процесс с правой боковой кормушкой. Следите за тем, чтобы жидкость, добавляемая в боковые кормушки, не сливалась по центру крышки и оставляла зазор для газообмена.

Если добавить слишком много жидкости, она просочится внутрь крышки и впоследствии попадет во внешнее отверстие планшета для культуры тканей 384. По прошествии 30 минут рассмотрите клетки под микроскопом. Отдых пластин в течение 30 минут позволяет клеткам полностью осесть на дне лунки и вплотную друг к другу, что важно для образования одиночных сфероидов на лунку.

Центрифугируйте засеянные планшеты в течение 15 минут при четырехкратной перегрузке. После отжима заполните резервуар для жидкости планшета для культуры тканей 384 стерильной водой и замените обычные крышки планшетов крышками, заполненными жидкостью для окружающей среды. Поместите планшеты во вращающийся инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с влажностью 95 процентов, 5 процентами CO2 и 20 процентами кислорода и позвольте клеткам агрегироваться в многоклеточные опухолевые сфероиды или MCTS в течение четырех дней. Избегайте слишком долгого открытия дверцы инкубатора в последующие дни, чтобы уровень влажности не упал резко.

На четвертый день после формирования NCTS используйте автоматический дозатор для промывки микропланшетов, чтобы добавить 30 микролитров предварительно подогретой среды в каждую лунку. Поместите MCTS обратно в инкубатор и дайте им расти, пока они не достигнут желаемого размера для экспериментов. Каждые три дня для замены среды опытным путем регулируйте высоту Z промывочного коллектора и устанавливайте скорость дозирования и скорость, с которой промывочный коллектор опускается в лунки с наименьшей скоростью, чтобы свести к минимуму турбулентность в лунках.

Отсадите 30 микролитров среды на лунку и замените ее 30 микролитрами свежей, предварительно подогретой среды. Затем верните клетки в инкубатор. Визуализируйте MCTS в автоматизированной системе визуализации с высоким содержанием изображения с использованием четырехкратного воздушного прицеливания с числовой апертурой 16.

Используя программное обеспечение для обработки изображений, установите время экспозиции на 11 миллисекунд, а интервал — на четыре на четыре. Отрегулируйте количество и расстояние между z-стеками и биннингом пикселей по мере необходимости, чтобы эксперимент захватывал весь MCTS в каждой лунке. Обрабатывайте 2D-изображения поэтапно, чтобы измерить площадь MCTS, большую и малую ось, периметр и плотность.

Пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым m-кодом и текстовыми файлами для чтения меня для получения конкретных инструкций. Чтобы определить потенциальную применимость рутины, семидневные MCTS получали различные концентрации противораковых препаратов: паклитаксел, PTX, винкристин, VCR, оксалиплатин, OXA, доксирубицин, DOX, и пять флурурацилов, 5-FU, в трех различных концентрациях в течение четырех дней. Изображения MCTS показаны здесь.

Эти изображения были проанализированы для определения площади, большой и малой осей, периметра и плотности обработанных лекарственным препаратом MCTS по сравнению с контролем, CTL. Для расчета геометрического объема использовались большая и малая оси. Наблюдалось концентрационное зависимое уменьшение площади и объема МСТС после лечения препаратом.

Несмотря на то, что ноль целых один микрограмм на миллилитр Винкристина и ноль целых четыре микрограмма на миллилитр Доксирубицина и пяти Фторурацила привели к увеличению площади МСТС, объем был значительно увеличен только после нулевой точки ноль одного микрограмма на миллилитр Винкристина. Периметр МСТС достоверно отличался только при самых высоких концентрациях паклитаксела, доксирубицина и пяти флевроурацила, которые полностью влияли на размер МСТС. Прием Паклитаксела и Винкристина в дозе ноль целых две пять микрограмм на миллилитр и ноль целых ноль целых шесть микрограммов на миллилитр и Доксирубицин и Пять флевроурацилов в концентрации 100 микрограммов на миллилитр привел к значительному снижению твердости, что указывает на полный или частичный распад МСТС.

В совокупности эти данные демонстрируют полезность этого метода в исследовании потенциальных противораковых препаратов. После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно отметить, что не все клеточные линии подходят для конкретного метода 3D-культивирования, и разные клеточные линии образуют сфероиды, которые демонстрируют различия в форме сфероидов, размере, гистологии и кинетике роста.

Разработанная нами стимулирующая процедура позволяет эффективно оценивать размер сфероида, особенно в частично разрушенных сфероидах, обработанных лекарственными препаратами, которые не имеют четко определенной границы для измерения площади поперечного сечения. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать тот факт, что представленная здесь модификация не требует никакого дополнительного оборудования или расходных материалов и может быть рутинно внедрена в вашей лаборатории скрининга членистоногих.