Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

ДИКТОР Общая цель данного метода заключается в эффективном получении большого количества стабильных клеточных сфероидов путем агрегации клеток для их последующего использования в различных клеточных анализах. Основным преимуществом этого метода является использование небелкового водорастворимого матрикса для агрегации клеток и формирования сфероидов, что обеспечивает простое и быстрое выделение сфероидов. Данный метод может помочь в получении новых данных в области клеточной биологии о влиянии взаимодействий между клетками, а также между клетками и матриксом, на рост тканей в трехмерной микросреде.

ДИКТОР Перед приготовлением агрегатов нагрейте 50 мл ультрачистой воды до 80 °C и добавьте 10 г порошка метилцеллюлозы. Перемешивайте суспензию до равномерного распределения частиц. Затем добавьте холодную ультрачистую воду до конечного объема 100 мл и выдержите частицы в течение ночи при 4 °C, пока раствор не станет прозрачным, соломенно-желтым и не перестанет содержать видимые твердые частицы.

Пропустите раствор через фильтр с порами 0.45 µm для удаления нерастворенных фрагций и разведите отфильтрованный раствор в соответствующей культуральной среде до концентрации 1:5 mg/mL. Затем профильтруйте среду с добавлением метилцеллюлозы через фильтр с порами 0.22 µm. Далее, в боксе биологической безопасности, промойте субкультуру с конфлюэнтностью 70% раствором PBS и обработайте клетки тремя миллилитрами буфера для открепления Trypsin-EDTA в инкубаторе для культур клеток.

Через несколько минут осмотрите клетки под световым микроскопом при 10-кратном увеличении. Когда клетки открепятся от планшета, нейтрализуйте реакцию, добавив 7 мл культуральной среды с сывороткой. Перенесите клеточную суспензию в новую пробирку объемом 15 мл, после чего соберите высвобожденные клетки путем центрифугирования.

Наиболее распространенной причиной неудачного формирования сфероидов, помимо наличия загрязняющих частиц, является использование субоптимальных концентраций метилцеллюлозы или сыворотки для агрегации и роста конкретной клеточной линии. ДИКТОР: Используя микропипетку P1000 с фильтровым наконечником, тритрируйте осадок от трех до пяти раз с одним миллилитром среды для формирования сфероидов, прижимая кончик пипетки к дну пробирки под небольшим углом и медленно пипетируя, не выдувая все содержимое наконечника, чтобы разрушить структуру осадка. После подсчета разведите клеточную суспензию до концентрации 1 × 10⁴ клеток на мл, а стерильный резервуар для многоканальной пипетки промойте фильтрованной сверхчистой водой для удаления пыли и волокон.

Перенесите клетки в резервуар и с помощью фильтрующих наконечников распределите по 100 µL клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета с низкоадгезивным покрытием, периодически перемешивая суспензию, чтобы предотвратить осаждение клеток на дно резервуара. После заполнения всех лунок поместите планшет в инкубатор для культур тканей и ежедневно проверяйте лунки на предмет образования сфероидов. Клетки должны осесть на дно каждой лунки в течение шести часов и, как правило, агрегировать в сфероид в течение 24–48 часов.

Чтобы подтвердить успешное формирование сфероида, используйте наконечник P10 под световым микроскопом, чтобы осторожно нанести среду на сфероид с помощью пипетки. Правильно сформированные сфероиды отделятся от поверхности планшета и будут перекатываться, что подтверждает их трехмерную структуру. Для встраивания сфероидов в коллаген используйте метод обратного пипетирования, чтобы равномерно покрыть дно каждой лунки предметного стекла с восьмью лунками для культивирования тканей слоем нейтрализованного коллагена объемом не менее 50 µl на лунку.

Когда все лунки будут закрыты, поместите камерный слайд в чашку для культивирования тканей диаметром 35 мм, заполненную ультрачистой водой, затем поставьте её в чашку для культивирования тканей диаметром 10 см и инкубируйте последнюю при 37 °C в течение примерно одного часа. После полимеризации коллагена с помощью фильтрационного наконечника P1000 аккуратно перенесите сформированные сфероиды в микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл. Важно инкубировать базовые слои коллагена до их полной полимеризации, чтобы избежать нарушения структуры коллагена при добавлении сфероидов или среды.

Диктор: Соберите полученные сфероиды с помощью настольной микроцентрифуги и используйте дозатор P200 для удаления супернатанта, при необходимости удаляя остатки супернатанта путем переворота пробирки на чистое бумажное полотенце. Используя наконечник для дозатора P200 с широким отверстием, немедленно ресуспендируйте сфероиды в 50 µL нейтрализованного коллагена и осторожно перенесите смеси сфероидов с коллагеном в каждую лунку восьмилуночного предметного стекла для культивирования тканей. Поместите стекло обратно в инкубатор до полимеризации коллагена.

Примерно через час в каждую лунку для дальнейшей инкубации медленно добавьте не менее 100 µL подогретой культуральной среды с соответствующим исследуемым препаратом. Затем с помощью флуоресцентного микроскопа получите оптические срезы изображений через инвазивные сфероиды. Используя данный протокол, можно создавать сфероиды из различных клеточных линий.

При соответствующих условиях обработки метилцеллюлозой и сывороткой отдельные клетки оседают и слипаются в центре лунки, образуя сфероиды с минимальной адгезией к дну лунки. Некоторые клеточные линии способны прикрепляться к низкоадгезивным планшетам при отсутствии или низких концентрациях метилцеллюлозы, что приводит к формированию сфероида, окруженного монослоем клеток. В целом, более высокие концентрации метилцеллюлозы препятствуют прикреплению клеток к стенкам лунки.

Однако слишком высокая концентрация метилцеллюлозы снижает адгезию клеток друг к другу и препятствует их оседанию на дно лунки, что приводит к образованию рыхлых агрегатов и многочисленных сателлитных сфероидов. Сфероиды, внедренные в коллаген, можно обрабатывать хемоаттрактантом для индукции инвазии отдельных клеток из сфероида в окружающий матрикс. Фиксированные сфероиды в коллагене можно исследовать с помощью светлопольной микроскопии для количественной оценки расстояния и числа инвазивных клеток или с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии для визуализации инвазивных структур, сформированных мигрирующими клетками.

Важно выделить достаточное время для агрегации клеток в структурно стабильные сфероиды, которые были бы достаточно прочными для манипуляций без фрагментации и могли быть легко собраны для использования в последующих анализах. Наш протокол выращивания клеток может быть дополнительно адаптирован для различных методов клеточной биологии. Например, помещение клеток в среды с высокой концентрацией метилцеллюлозы может использоваться для оценки резистентности клеток к аноксии.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как создавать трехмерные клеточные сфероиды методом агрегации, что станет ценным инструментом для многих приложений в области клеточной биологии.