Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Общая цель этого метода заключается в эффективном получении большого количества устойчивых клеточных сфероидов путем клеточной агрегации для их использования в различных клеточных анализах. Основное преимущество этой методики заключается в том, что в ней используется небелковая водорастворимая матрица для агрегации клеток и формирования сфероидов, что позволяет легко и быстро выделить сфероиды. Этот метод может помочь получить новые знания в клеточной биологии о влиянии межклеточных взаимодействий и взаимодействий клетки/матрицы на рост тканей в трехмерном микроокружении.

ДИКТОР Перед приготовлением заполнителей нагрейте 50 миллилитров сверхчистой воды до 80 градусов Цельсия, и добавьте 10 грамм порошка метилцеллюлозы. Взбалтывайте суспензию до тех пор, пока частицы не разойдутся. Затем добавьте холодную сверхчистую воду до конечного объема 100 миллилитров и храните частицы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, пока раствор не станет прозрачным и соломенного цвета без видимых твердых веществ.

Пропустите раствор через фильтр 0,45 микрометра, чтобы удалить все нерастворенные фрагменты, и разведите 1:5 миллиграмма на миллилитр отфильтрованного раствора в соответствующей питательной среде. Затем фильтруйте среду с добавлением метилцеллюлозы через сетчатое фильтр 0,22 мкм. Затем в шкафу биологической безопасности промойте 70%-ную конфлюентную субкультуру PBS и присоедините клетки с тремя миллилитрами ассоциативного буфера Trypsin-EDTA в инкубаторе для клеточных культур.

Через несколько минут осмотрите клетки под световым микроскопом при 10-кратном увеличении. Когда клетки оторвутся от пластины, нейтрализуйте реакцию семью миллилитрами сыворотки, дополненной питательной средой. Переложите клеточный раствор в свежую 15-миллилитровую пробирку, а затем соберите освобожденные клетки методом центрифугирования.

Наиболее распространенной причиной неудачного образования сфероидов, помимо загрязняющих частиц, является использование неоптимальных концентраций метилцеллюлозы или сыворотки для агрегации и роста вашей конкретной клеточной линии. ДИКТОР - С помощью микропипетки P1000 с фильтрующим наконечником внесите в поддон от трех до пяти раз один миллилитр среды для образования сфероидов, прижимая кончик пипетки к дну пробирки под небольшим углом, одновременно медленно пипетируя, не выталкивая все содержимое наконечника, чтобы очистить гранулу. После подсчета разбавьте клеточную суспензию до концентрации от 10 до 10 до четвертой клетки на миллилитр и промойте стерильный многоканальный резервуар для пипетки фильтрованной ультрачистой водой, чтобы удалить пыль и волокна.

Диспонируйте клетки в резервуар и с помощью фильтровальных наконечников переведите 100 микролитров клеток в каждую лунку 96-луночной U-образной репеллентной пластины, периодически перемешивая клеточную суспензию, чтобы предотвратить оседание клеток на дно резервуара. Когда все клетки будут размещены, поместите планшет в инкубатор для тканевых культур и ежедневно осматривайте лунки на предмет образования сфероидов. Ячейки должны осесть на дно каждой лунки в течение шести часов и, как правило, объединяться в сфероид в течение 24-48 часов.

Чтобы подтвердить успешное формирование сфероида, используйте наконечник P10 под световым микроскопом, чтобы аккуратно провести пипеткой среду над сфероидом. Правильно сформированные сфероиды отсоединятся от пластины и скатятся, подтвердив свою трехмерную структуру. Чтобы внедрить сфероиды в коллаген, используйте обратное пипетирование, чтобы равномерно покрыть дно каждой лунки восьмилуночного предметного стекла камеры для культивирования тканей минимальным количеством 50 микролитров нейтрализованного коллагена на лунку.

Когда все лунки будут закрыты, поместите предметное стекло камеры в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, наполненную сверхчистой водой, в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей и инкубируйте 10-сантиметровую чашку для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Когда коллаген полимеризуется, используйте наконечник фильтра P1000, чтобы аккуратно перенести предварительно сформированные сфероиды в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Крайне важно, чтобы базовые слои коллагена инкубировались до тех пор, пока они полностью не полимеризуются, чтобы не нарушить коллаген при добавлении сфероидов или среды.

Соберите собранные сфероиды в настольной микроцентрифуге и с помощью пипетки P200 удалите надосадочную жидкость, удаляя излишки надосадочной жидкости путем инверсии пробирки на чистом бумажном полотенце, если это необходимо. С помощью наконечника пипетки P200 с широким отверстием немедленно повторно суспендируйте сфероиды в 50 микролитрах нейтрализованного коллагена и осторожно перенесите смеси сфероидного коллагена в каждую лунку из восьмилуночной камеры для культивирования тканей. Верните предметное стекло в инкубатор до тех пор, пока коллаген не полимеризуется.

Примерно через час медленно добавьте не менее 100 микролитров подогретой питательной среды, содержащей соответствующую интересующую обработку, в каждую лунку для очередной инкубации. Затем используйте флуоресцентный микроскоп для получения оптических срезов через вторгшиеся сфероиды. Используя этот протокол, сфероиды могут быть получены из различных клеточных линий.

При соответствующих условиях обработки метилцеллюлозой и сывороткой отдельные клетки оседают и прилипают друг к другу в центре лунки, образуя сфероиды с минимальным прилеганием к дну лунки. Некоторые клеточные линии способны прилипать к клеточным репеллентным пластинам при отсутствии или при низких концентрациях метилцеллюлозы, что приводит к образованию сфероида, окруженного клеточным монослоем. В целом, более высокие концентрации метилцеллюлозы препятствуют прилипанию клеток к лунке.

Но слишком высокая концентрация метилцеллюлозы снижает адгезию между клетками, и препятствует оседанию клеток на дно скважины, что приводит к образованию рыхлых агрегатов и многочисленных сателлитных сфероидов. Сфероиды, встроенные в коллаген, могут быть обработаны хемоаттрактантом, чтобы вызвать вторжение отдельных клеток наружу из сфероида в окружающий матрикс. Неподвижные сфероиды, встроенные в коллаген, могут быть визуализированы с помощью светлопольной микроскопии для количественной оценки расстояния и количества вторгшихся клеток или с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии для визуализации инвазивных структур, образованных мигрирующими клетками.

Важно дать достаточно времени для того, чтобы клетки агрегировались в структурно здоровые сфероиды, которые достаточно прочны для манипулирования ими без фрагментации, и которые могут быть легко собраны для использования в последующих анализах. Наш протокол клеточного роста может быть дополнительно адаптирован для проведения нескольких анализов клеточной биологии. Например, для оценки устойчивости к целланою можно использовать размещение клеток в средах с добавлением высоких концентраций метилцеллюлозы.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить трехмерные клеточные сфероиды путем агрегации, что станет ценным инструментом для многих приложений клеточной биологии.