Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Общая цель этой процедуры заключается в точном измерении жизнеспособности клеток в культуре гранулярных нейронов мозжечка. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки и нейрофармакологии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем отличить нежелательные глиальные клетки от нейронов в культурах клеток MISTA.

Демонстрировать процедуры будут Линь Цзяцзя, Ван Цзялин, Сюй Дилинь, три студента бакалавриата из моей лаборатории. Начните препарирование голов восьмидневных крысят, сначала вставив ножницы в большое затылочное отверстие и разрезав две стороны черепа от ушей до глаз. Затем используйте щипцы, чтобы поднять череп.

С помощью щипцов изолируйте мозжечок, и поместите его в 35-миллиметровую посуду с раствором для рассечения. Перенесите пластину на столик препарирующего микроскопа и с помощью двух пар щипцов удалите мозговые оболочки и кровеносные сосуды. С помощью лезвия измельчите ткани, а затем перенесите ткань в центрифужную пробирку, содержащую 30 миллилитров раствора для вскрытия.

Центрифуга в течение пяти минут при комнатной температуре 1,500 х г. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и сохраните гранулу. Далее добавьте в гранулу раствор трипсина и повторно суспендируйте, слегка встряхивая.

Затем поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. Через 15 минут добавьте раствор DNase One, ингибитора трипсина сои и сульфата магния и встряхните. Затем центрифугировать в течение пяти минут при комнатной температуре 1,500 х г.

После аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в менее разбавленной DNase One, ингибиторе трипсина сои и растворе сульфата магния. Далее подготовьте две 15-миллилитровые трубки. Поместите половину клеток в каждую пробирку и пипетируйте вверх и вниз от 60 до 70 раз, используя ватную пипетку Пастера для гомогенизации клеток.

После гомогенизации добавьте по три миллилитра сульфата магния и раствор хлорида кальция в каждую 15-миллилитровую тюбик. Дайте трубкам постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. По истечении этого времени осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью ватной пипетки Пастера и переложите в новые 15-миллилитровые пробирки.

Центрифугировать в течение пяти минут при комнатной температуре и 1,500 х г. Добавьте питательную среду к грануле для разбавления до плотности клеток примерно 1,5 х 10 до шестой клетки на миллилитр. Пипетируйте клетки в 6-луночный планшет и культивируйте в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Через 24 часа добавьте стоковый раствор AraC в конечную концентрацию в один миллимоляр для подавления роста глиальных клеток перед возвращением планшетов в инкубатор. Затем, на седьмой день, добавьте 50 микролитров в исходный раствор D-глюкозы до конечной концентрации в один миллимоляр. Начните окрашивание с смешивания диацетата флуоресцеина до конечной концентрации 10 микрограмм на миллилитр и йодида пропидиума до конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр и 10 миллилитров PBS.

Смешайте раствор FDA/PI путем вортекса и положите на лед. Положите тарелку с культурой на лед. Осторожно отсасывайте питательную среду, не касаясь клеток наконечником пипетки, затем медленно добавляйте холодный PBS.

Аспирируйте PBS, затем добавьте холодный рабочий раствор FDA/PI или FDA/PI Hoechst. Поставьте тарелку на лед на пять минут. Затем, после аспирации рабочего раствора FDA/PI или FDA/PI/Hoechst, добавьте холодный PBS в каждую лунку.

Убедитесь, что флуоресцентный микроскоп настроен правильно. Определение флуоресцентного излучения для FDA, PI и Hoechst на 520, 620 и 460 нанометрах соответственно, используя время воздействия от 100 до 300 миллисекунд и аналоговое усиление 2,8x. После сбора флуоресцентных изображений сделайте снимок при нормальном освещении в режиме фазового контраста.

Для двойного окрашивания FDA/PI наложите изображения клеток, перетащив положительный слой FDA поверх положительного слоя PI в программном обеспечении для редактирования графики. Отрегулируйте непрозрачность положительного слоя FDA, введя 50% в поле Непрозрачность на панели Слои. Объедините два слоя, открыв меню Слой и нажав на кнопку Объединить видимые.

Установите контрастность наложенных изображений, введя 50 в поле Контраст в разделе Изображение, Коррекция, Яркость/Контрастность. Убедитесь, что на наложенных изображениях нет двойных положительных клеток FDA и PI. Для тройного окрашивания FDA/PI/Hoechst наложите изображения клеток, снова перетащив положительный слой FDA на положительный слой PI, отрегулировав непрозрачность положительного слоя FDA и объединив изображения, как и раньше.

Затем перетащите положительный слой Хёхста на объединенный слой. Отрегулируйте непрозрачность положительного слоя Хёхста, введя 50% в поле Непрозрачности панели Слоёв, и объедините два слоя, открыв меню Слой и нажав на кнопку Объединить видимый. Визуально отличайте большие, неправильные глиальные клетки от зернистых нейронов мозжечка, сравнивая изображения, сделанные в флуоресцентном режиме, с изображениями, полученными в режиме фазового контраста.

Следующие изображения показывают, что в культуре CGN присутствуют как маленькие нейроны, так и большие, неправильные глиальные клетки. На этом изображении показано аминоокрашивание GAP-43 культуры CGN в течение восьми дней in vitro. Синими стрелками обозначены нейроны.

Здесь показано аминоокрашивание глиальных клеток GFAP. Белая стрелка указывает на глиальную клетку. На этом изображении фазового контраста показана морфология клеток.

Окрашивание крючком FDA/PI, которое может отличить глиальные клетки от нейронов, является преимуществом для точной оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN. Это объединенное изображение трижды окрашенных клеток, выращенных в нормальной питательной среде. Стрелкой показана типичная глиальная клетка.

Здесь аналогичная культура была обработана средой, содержащей низкое содержание калия, и стрелка снова указывает на типичную глиальную клетку. Также обратите внимание на появление красного пятна йодидом пропидия. После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если она выполнена правильно.

Аналогичная стратегия может быть применена к другим смешанным культурам клеток, таким как первичные культуры коры головного мозга и первичные культуры гиппокампа для точного анализа жизнеспособности нейронов.