Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Общая цель данной процедуры заключается в точном измерении жизнеспособности клеток в культуре гранулярных нейронов мозжечка. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и нейрофармакологии. Основным преимуществом данной методики является возможность отличить нежелательные глиальные клетки от нейронов в клеточных культурах MISTA.

Процедуры будут демонстрировать Линь Цзяцзя, Ван Цзялин и Сюй Дилин — три студента бакалавриата из моей лаборатории. Начните вскрытие голов восьмидневных крысят, сначала вставив ножницы в большое затылочное отверстие и разрезав череп с двух сторон от ушей к глазам. Затем с помощью пинцета приподнимите череп.

С помощью пинцета изолируйте мозжечок и поместите его в чашку диаметром 35 мм с раствором для диссекции. Перенесите чашку на предметный столик диссекционного микроскопа и с помощью двух пинцетов удалите мозговые оболочки и кровеносные сосуды. Измельчите ткани лезвием, затем перенесите их в центрифужную пробирку, содержащую 30 мл раствора для диссекции.

Центрифугируйте в течение пяти минут при комнатной температуре при 1 500 x g. После центрифугирования аспирируйте супернатант и сохраните осадок. Затем добавьте к осадку раствор трипсина и ресуспендируйте, осторожно встряхивая пробирку.

Затем поместите пробирку в водяную баню при 37 °C на 15 минут. Через 15 минут добавьте раствор DNase One, ингибитора трипсина из сои и сульфата магния, после чего перемешайте. Затем центрифугируйте в течение пяти минут при комнатной температуре при 1 500 ×g.

После аспирации супернатанта ресуспендируйте осадок в менее разбавленном растворе DNase One, ингибитора трипсина сои и сульфата магния. Затем подготовьте две пробирки объемом 15 мл. Поместите половину клеток в каждую пробику и 60–70 раз перемешайте содержимое каждой пробирки с помощью пастуровской пипетки с ватным тампоном для гомогенизации клеток.

После гомогенизации в каждую пробирку объемом 15 мл добавьте три миллилитра раствора сульфата магния и хлорида кальция. Выдержите пробирки при комнатной температуре в течение 10 минут. По истечении этого времени осторожно удалите супернатант с помощью пастеровской пипетки с хлопковой пробкой и перенесите его в новые пробирки объемом 15 мл.

Центрифугируйте в течение пяти минут при комнатной температуре и 1, 500 x g. Добавьте культуральную среду к осадку, чтобы развести клетки до плотности примерно 1.5 x 10⁶ клеток на миллилитр. Перенесите клетки пипеткой в 6-луночный планшет и культивируйте в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.

Через 24 часа добавьте имеющийсяся запасной раствор AraC до конечной концентрации 1 mM, чтобы подавить рост глиальных клеток, перед тем как вернуть планшеты в инкубатор. Затем, на седьмой день, добавьте 50 µL запасного раствора D-glucose до конечной концентрации 1 mM. Начните окрашивание, смешав флуоресцеиновый диацетат до конечной концентрации 10 µg/mL, пропидий иодид до конечной концентрации 50 µg/mL и 10 mL PBS.

Перемешайте раствор FDA/PI с помощью вортекса и поместите на лед. Поместите планшет с культурой на лед. Осторожно аспирируйте культуральную среду, не касаясь клеток наконечником пипетки, затем медленно добавьте холодный PBS.

Отсосите PBS, затем добавьте холодный рабочий раствор FDA/PI или FDA/PI/Hoechst. Поместите планшет на лед на пять минут. Затем, после отсасывания рабочего раствора FDA/PI или FDA/PI/Hoechst, добавьте холодный PBS в каждую лунку.

Убедитесь, что флуоресцентный микроскоп настроен правильно. Зарегистрируйте флуоресцентное излучение FDA, PI и Hoechst при 520, 620 и 460 нанометрах соответственно, используя время экспозиции от 100 до 300 миллисекунд и аналоговое усиление 2.8 x. После получения флуоресцентных изображений сделайте снимок при обычном свете, используя режим фазового контраста.

Для двойного окрашивания FDA/PI наложите изображения клеток друг на друга, перетащив слой с положительным окрашиванием FDA поверх слоя с положительным окрашиванием PI в графическом редакторе. Отрегулируйте непрозрачность слоя FDA, введя 50% в поле «Непрозрачность» (Opacity) панели слоев. Объедините два слоя, открыв меню «Слой» (Layer) и нажав кнопку «Объединить видимые» (Merge Visible).

Установите контрастность наложенных изображений, введя значение 50 в поле Contrast в меню Image, Adjustments, Brightness/Contrast. Убедитесь, что на наложенных изображениях отсутствуют клетки, одновременно положительные по FDA и PI. При тройном окрашивании FDA/PI/Hoechst наложите изображения клеток, снова перетащив слой с FDA-положительными клетками на слой с PI-положительными клетками, отрегулировав непрозрачность слоя с FDA-положительными клетками и объединив изображения, как описано ранее.

Затем перетащите слой с положительным окрашиванием Hoechst на объединенный слой. Отрегулируйте непрозрачность слоя с положительным окрашиванием Hoechst, введя 50% в поле Opacity (Непрозрачность) панели Layers (Слои), и объедините два слоя, открыв меню Layer (Слой) и нажав кнопку Merge Visible (Объединить видимые). Визуально отличите крупные неправильные глиальные клетки от гранулярных нейронов мозжечка, сравнив изображения, полученные в режиме флуоресценции, с изображениями, полученными в режиме фазового контраста.

На следующих изображениях видно, что в культуре CGN присутствуют как мелкие нейроны, так и крупные неправильной формы глиальные клетки. На данном изображении представлено окрашивание на белок GAP-43 в культуре CGN через восемь дней in vitro. Синие стрелки указывают на нейроны.

Здесь представлено амино-окрашивание глиальных клеток на GFAP. Белая стрелка указывает на глиальную клетку. Данное изображение, полученное методом фазового контраста, демонстрирует морфологию клеток.

Окрашивание с помощью FDA/PI, позволяющее отличить глиальные клетки от нейронов, является преимуществом для точной оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN. На данном изображении представлено совмещение снимков клеток с тройным окрашиванием, выращенных в нормальной ростовой среде. Стрелка указывает на типичную глиальную клетку.

Здесь аналогичная культура была обработана средой с низким содержанием калия, и стрелка снова указывает на типичную глиальную клетку. Также обратите внимание на вид окрашивания пропидия йодидом красного цвета. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура занимает два часа.

Аналогичную стратегию можно применить и к другим смешанным клеточным культурам, таким как первичные культуры коры головного мозга и первичные культуры гиппокампа, для точного анализа жизнеспособности нейронов.