Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов

Общая цель этого протокола заключается в химическом очистке сердца мыши с индуцированной сердечной аритмией для визуализации лейкоцитарного инфильтрата сердца всего органа с помощью флуоресцентной световой листовой микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования всего органа о протезах и структурах на уровне клеточного разрешения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет как количественно оценить, так и локализовать воспаление в целых органах.

Детальное введение внутренностей в неврологический протез. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы срочно нуждались в инструменте визуализации для выявления клеточных объяснений сердечной аритмии в модуле истощения. После экспозиции сердца у восьми-10-недельной мыши с помощью катетера 21 калибра проникают в правый желудочек.

Разрежьте аорту, чтобы обеспечить отток крови, а затем перфузируйте пятью миллилитрами PBS плюс ЭДТА с медленным постоянным давлением. После PBS EDTA добавьте пять миллилитров 4% параформальдегида. В конце перфузии с помощью зубчатых щипцов аккуратно захватите неподвижное сердце и слегка потяните орган вверх, чтобы перерезать все тканевые соединения.

В том числе входящие и исходящие артерии и вены. Затем храните сердце в течение четырех часов в свежем 4% PFA для дальнейшей фиксации. Для обезвоживания ткани инкубируйте сердце в восходящем этанольном ряду, в черных пятимиллилитровых полипропиленовых реакционных трубках в темноте, с постоянным медленным вращением на вращателе трубки, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

Затем очистите ткань с помощью инкубации 98% дибензилового эфира с постоянным вращением в течение ночи. Чтобы провести флуоресцентную микроскопию светового листа, сначала поместите обезвоженные агарозные блоки в стандартный держатель образца, чтобы удерживать образец на месте. Затем переложите образец на держатель для образцов.

Затем перенесите держатель образца в кювету, наполненную дибензиловым эфиром соответствующего размера. Используйте соответствующие настройки фильтра возбуждения и излучения для обнаружения интересующих сигналов флуоресценции. Таким образом, правильное позиционирование и фиксация образца имеют основополагающее значение для минимизации эффектов затенения во время визуализации.

Кроме того, незакрепленный образец может привести к появлению движущихся артефактов, которые трудно осветить во время постобработки. После запроса всех изображений откройте соответствующее программное обеспечение для анализа 3D и 4D изображений и выберите «Превзойти». Выберите файл и открыть, а затем выберите папку, содержащую данные из первого полученного канала, чтобы открыть стеки изображений.

Выберите «Редактировать» и «Добавить каналы», чтобы добавить соответствующие полученные данные флуоресцентных каналов. Затем нажмите «Редактировать» и выберите свойства изображения, чтобы скорректировать размеры вокселей x, y и z. Настройка параметров в открывшемся окне.

Чтобы настроить флуоресцентные сигналы, сначала откройте меню редактирования и выберите, показать настройку дисплея. В новом окне очень отображаются все открытые каналы. Чтобы изменить автофлуоресцентный канал на оттенки серого, выберите автофлуоресцентный канал, выберите белый стиль отображения и нажмите OK.

Затем отрегулируйте вид, удалив сетку. Затем увеличьте масштаб и отмените выбор одного канала. Затем отрегулируйте значение уровня черного, чтобы исключить любые нежелательные фоновые сигналы, которые не представляют структуру образца, интенсивность сигнала и контрастность.

Отрегулируйте стоячий канал антитела по отношению к пересмотренному сигналу автофлуоресцентного канала. Установив режим канала, выстрел для установки визуализации сигнала антитела на тепловую карту цветовой подсмотровой таблицы. Затем выберите режим наложения, чтобы детально визуализировать структуры тканей.

Чтобы виртуально разрезать орган, перед экспортом 3D-сцены выберите значок обтравочной плоскости в списке объектов. В окне изображения появится желтая рамка и манипулятор белого шпинделя. Используйте мышь, чтобы повернуть шпиндель на более тонком конце, чтобы изменить ориентацию плоскости обрезки, и переместите более толстую среднюю часть шпинделя, чтобы выбрать желаемую глубину обрезки.

Затем снимите соответствующие флажки, чтобы скрыть рамку и манипулятор и создать желаемые снимки. Получение всего стека изображений, состоящего из двух сигналов флуоресцентных каналов, приводит к искусственному 3D-рендерингу, в котором распределение лейкоцитов отображается в виде тепловой карты. Сильно воспаленные участки сердца у животных, получавших дифтерийный токсин, можно воспринимать по их красноватому, белесому внешнему виду.

В частности, в областях проводящей системы сердца, таких как пучок желудочков предсердий и волокна Пуркинье. В отличие от этого, сердца животных, получавших контролируемый PBS, не демонстрируют эту модель воспаления. После освоения эта техника позволяет проводить цифровой анализ органа-мишени, начиная с его забора и заканчивая компьютерной оздоровлением в течение четырех-пяти дней.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эмменологии к изучению закономерностей клеточного распределения в целых органах мыши. Это может быть возраст при анализе и лечении различных патофизиологических заболеваний протезов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подготовить целые органы мыши к флуоресцентной световой листовой микроскопии, а также как генерировать и обрабатывать стеки 3D-данных.