Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

Общая цель этих методов состоит в том, чтобы предоставить набор инструментов для обеспечения индукции, мониторинга и количественной оценки клеточного старения. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы об идентификации и количественной оценке клеточного старения и биологических факторов, которые регулируют клеточное старение и старение организмов. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они охватывают множество методов мониторинга клеточного старения в различных моделях, тканях и типах клеток.

Начните с нанесения на ранних стадиях пассажа интересующих вас пролиферативных клеток с разреженной плотностью в соответствующую чашку для анализа. И культивируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для культивирования тканей. Когда клетки сличатся на 50-60%, аспирируйте питательную среду и промойте клетки PBS два раза.

После второй промывки накройте ячейки тонким слоем PBS. И подвергнуть клетки однократной дозе гамма-облучения в 10 баллов. Замените PBS на питательную среду.

И вернуть клетки в инкубатор. Смена среды каждые 48-72 часа с ежедневным мониторингом морфологических изменений под световым микроскопом. Через 7-10 дней после облучения разморозьте все реагенты из коммерческого набора для анализа бета-галактозидазы, связанного со старением, в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда все реактивы достигнут комнатной температуры, приготовьте фиксирующие и окрашивающие растворы в соответствии с инструкциями производителя. И аккуратно промойте каждую лунку комнатной температурой PBS. Тщательно промывайте клетки, так как стареющие клетки плохо прилипают и могут быть легко удалены во время стирки.

Зафиксируйте клетки в каждой лунке одним миллилитром фиксирующего раствора на лунку на 10 – 15 минут при комнатной температуре. Далее следуют две двухмиллилитровые промывки с PBS на лунку. Далее добавьте по одному миллилитру раствора для окрашивания бета-галактозидазы в каждую лунку и накройте пластину алюминиевой фольгой на 24-48 часовую культуру в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа.

Проверьте ячейки в 24 часа. Когда клетки будут достаточно окрашены, замените раствор бета-гала свежим PBS и исследуйте культуры на световом микроскопе с прикрепленной камерой с объективом 10x или выше. Клетки бета-галактозидазы, связанные со старением, будут казаться голубыми.

Затем получите не менее пяти неперекрывающихся изображений на лунку. И вручную подсчитайте общее количество бета-галактозидазных положительных клеток, связанных со старением, и общее количество клеток на изображение, чтобы рассчитать процент бета-галактозидазных клеток, связанных со старением, на лунку. Через 10 дней после гамма-облучения трижды промыть клетки PBS.

После последней промывки замените PBS 2,5 миллилитрами сыворотки свободной среды, дополненной антибиотиками, на шестисантиметровую чашку и верните клетки в инкубатор для тканевых культур на ночь. На следующее утро переложите среду в коническую трубку на льду. И два раза промыть клетки свежим ПБС.

Затем трипсинизируйте и посчитайте клетки. Затем центрифугируйте надосадочную жидкость, собранную из планшета для клеточной культуры. А затем процедить ее через ситечко шприца 0,45 микрометра и заморозить среду в 500 микролитровых аликвотах при 80 градусах Цельсия до их анализа методом ИФА.

Повышенное старение, связанное с окрашиванием бета-гал, происходит с репликативным старением и старением, вызванным повреждением ДНК. Обратите внимание на увеличенную плоскую форму стареющих клеток по сравнению с веретенообразным видом пролиферирующих фибробластов. В этом эксперименте пролиферирующие молодые или репликативные стареющие клетки были зафиксированы, как описано в письменном протоколе.

И окрашен антителом против биомаркера двухцепочечных разрывов ДНК и DAPI. При явном увеличении количества двухцепочечных разрывов ДНК в стареющих клетках наблюдается разрыв фози. Анализ секреторных фенотипических факторов, связанных со старением, показывает, что, по крайней мере, некоторые факторы регулируются после старения, вызванного гамма-облучением, в диплоидных фибробластах человека с низким пассажем на уровне мРНК.

Что в дальнейшем подтверждается методом иммуноферментного анализа супернатантов культур гамма-облученных клеточных культур. После освоения индукция повреждения ДНК и окрашивание SA бета-гал могут быть завершены примерно за 30 минут практического времени. Кондиционная среда для количественного определения уровня белка SASP может быть приготовлена примерно за 30 минут.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о мониторинге морфологических изменений в клеточных культурах, прежде чем приступать к количественному определению маркеров старения. После его разработки эти методы проложили путь исследователям в области старения и рака к изучению старения в различных тканях, клеточных культурах и модельных организмах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать, контролировать и количественно измерять клеточное старение.