Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

Здесь показано, как анализ in situ Proximity Ligation Assay (PLA) может использоваться для обнаружения и визуализации прямых белково-белковых взаимодействий между АТМ и р53 в культурах суспензионных клеток, подверженных генотоксическому стрессу.

Общей целью данного эксперимента по анализу близкого лигирования является визуализация и количественная оценка формирования ответа на повреждение ДНК и репарации белковых комплексов после индукции повреждения ДНК в культурах суспензионных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы восстановления повреждений ДНК, такие как пространственно-временная организация и регуляция, а также то, как различные пути репарации реагируют на различные типы повреждений ДНК. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он относительно прост, требует небольшого количества клеток и не требует обширной обработки, которая может нарушить или изменить белок-белковые взаимодействия.

Хотя этот метод может дать представление о репарации ДНК, образовании белковых комплексов в культуральных суспензионных клетках, он также может быть применен к культивируемым адгезивным клеткам, замороженным или залитым парафином тканям и даже к целым животным. В этом исследовании используется BV-173 и культивируется в IMDM с добавками при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5% CO2. Поместите клетки в дозе от 10 до 10 до шестой на миллилитр в шестилуночном планшете по пять миллилитров на лунку.

Чтобы остановить клетки в фазе G1 клеточного цикла, добавьте пять микромоляров метансульфоната аммония в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5% CO2. На следующий день добавьте по пять микромоляров ингибитора ATM в каждую из двух лунок и верните планшет в инкубатор на 30 минут. Затем индуцируйте повреждение ДНК, добавив 50 нанограммов на миллилитр NCS в одну из лунок, которая была предварительно обработана ингибитором ATM, и в другую лунку, которая не была предварительно обработана.

Выдерживать в течение двух часов. Приготовьте 1XPBS плюс 10% BSA, насыпав пять граммов fraction-5 BSA поверх 50 миллилитров 1XPBS в стакан и дайте ему постоять при комнатной температуре, не встряхивая и не перемешивая, пока BSA не растворится. Медленно отфильтруйте PBS плюс 10% раствор BSA через фильтр 0,22 микрометра и держите на льду.

Соберите клетки с переносом содержимого каждой лунки в 15-миллилитровую трубку. Дважды промойте ячейки ледяным 1XBPS. После подсчета клеток ресуспендировать в два раза по 10 до шестой клетки на миллилитр в 1XBPS плюс 10% BSA.

Держите клетки на льду. Подготовьте микроскопические стекла для этой процедуры, тщательно отполировав их безворсовой тканью и обезжиривая, поместив 96% этанол в банку Coplin на пять минут. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение 10 минут.

Соберите микроскопические стекла в цитоспиновые цитологические воронки площадью шесть миллилитров. Нанесите предварительное покрытие на предметные стекла, впрыскав 50 микролитров 1XPBS плюс 10% BSA в каждую воронку и центрифугируйте в течение одной минуты при 500 об/мин. В каждую воронку добавьте по 100 микролитров клеточной суспензии и центрифугируйте при 500 об/мин в течение пяти минут.

Аккуратно разберите воронки и следите за тем, чтобы не задеть пятна на горках. Используйте блокатор жидкости Пап-ручки с пятимиллиметровым наконечником, чтобы нарисовать круг вокруг каждого места. Затем добавьте в каждое пятно по 50 микролитров 4%-ного раствора фиксации PFA.

И выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут промыть ячейки с 1XPBS в банке Coplin при комнатной температуре при слабом перемешивании. Стирайте таким образом три раза по пять минут каждый раз.

Высушите предметные стекла вокруг пятен безворсовой салфеткой и удалите как можно больше жидкости из пятен, наклонив предметное стекло и высушив безворсовой тканью. Добавьте 50 микролитров 0,25% Triton X в 1XPBS в каждое пятно и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания. Промойте предметные стекла в 50-60 миллилитрах TBS-T в банке Coplin при комнатной температуре с легким перемешиванием.

Три раза по пять минут каждый раз. Перед блокировкой постучите по TBS-T и высушите предметные стекла вокруг пятен безворсовой салфеткой. Удалите с пятна как можно больше жидкости.

Кратковременно перемешайте блокирующий раствор, а затем добавьте по одной капле около 40 микролитров в каждое пятно. Поместите предметные стекла в предварительно прогретую увлажненную камеру и выдерживайте в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия. Приготовьте коктейли с антителами.

Вихревой, а затем пипеткой впрыскивайте коммерческий разбавитель антител в каждую микрофугированную пробирку. Добавьте антитело козы anti ATM в соотношении 1:1000. А у кролика антитело к фосфосерину-15 р53 в соотношении 1:100.

Для экспериментов по контролю одиночных антител готовят разведения антител, содержащие только козье анти-ATM антитело и только кроличье антитело к фосфосерину-15 p53. По завершении часовой инкубации слейте раствор для блокировки, но следите за тем, чтобы клетки не высохли. Добавьте по 30 микролитров каждого разбавления коктейля антител и инкубируйте во влажной камере при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день промойте предметные стекла с помощью 1X NC2 буфера для стирки A в банке Coplin при комнатной температуре с легким перемешиванием два раза по пять минут каждый раз. После того, как предметные стекла были дважды промыты промывочным буфером, снимите промывочный буфер со стекол и добавьте 30 микролитров смеси зонда для бесконтактного лигирования в каждое пятно. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно прогретой увлажненной камере в течение одного часа.

Промойте предметные стекла с 50-60 миллилитрами буфера для стирки А в банке Coplin при комнатной температуре с легким перемешиванием. Далее приготовьте раствор лигазы для лигирования на льду, добавив один микролитр лигазы на 39 микролитров раствора лигаза на каждое пятно. Добавьте по 40 микролитров раствора лигион-лигазы в каждое пятно.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно прогретой увлажненной камере в течение 30 минут. Вымойте предметные стекла с буфером для промывки А в банке Coplin при комнатной температуре с легким перемешиванием. Приготовьте амплификацию полимеразной смеси на льду.

Сначала разведите амплификаторный стоковый раствор один к пяти в воде. И добавьте 0,5 микролитра полимеразы к 39,5 микролитрам раствора 1Х амплификации на каждое пятно. Постучите по буферу для промывки и добавьте 40 микролитров амплификационной полимеразной смеси на каждое пятно.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно прогретой увлажненной камере в течение 100 минут. По окончании 100-минутной инкубации вылейте полимеразную смесь амплификации и промойте предметные стекла 1X NC2 промывочным буфером B в банке Coplin. При комнатной температуре с легким помешиванием два раза по 10 минут каждый.

После этого промойте предметные стекла в 0,01x буфере для промывки B в течение одной минуты. Стряхните излишки буфера для стирки B и высушите предметные стекла вокруг пятен безворсовой салфеткой. Удалите с пятна как можно больше жидкости.

Приготовьте DAPI, содержащую монтажную среду, которая не будет перекрашивать ядра, разбавив DAPI, содержащую монтажную среду 1:5, в монтажной среде без DAPI. Добавьте от 25 до 30 микролитров разбавленного DAPI, содержащего монтажную среду, в защитное стекло размером 24 на 24 миллиметра. Поднимите крышку с помощью ползуна и слегка надавите, чтобы убедиться, что в нем нет пузырьков воздуха.

Заклейте покровное стекло лаком для ногтей и подождите не менее 15 минут, прежде чем делать снимок. Наконец, визуализируйте и проанализируйте предметные стекла с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. Анализ близости-лигирования был использован для изучения взаимодействия между ATM и фосфосерином 15 p53 в BV 173 BCR-положительных клетках человека, арестованных в фазе G1.

В отличие от клеток, которые не обрабатывались NCS для индуцирования повреждения ДНК, большинство клеток, обработанных NCS, имели точечные сигналы исключительно в ядре, в среднем семь сигналов на клетку. Это указывает на то, что индукция повреждения ДНК приводит к взаимодействию между ATM и фосфосерином 15 p53. Предварительная обработка клеток специфическим ингибитором ATM-киназы до индукции повреждения ДНК уменьшает количество сигналов в среднем до двух сигналов на клетку, подтверждая, что фосфорилирование p53 на остаточном серине 15 зависело от активности ATM-киназы.

Эксперименты по контролю одного антитела, в которых выделялось либо антиATM, либо антитело против фосфосерина 15 p53, не дали ожидаемых сигналов. На рисунке представлен количественный и статистический анализ результатов, которые демонстрируют и подтверждают специфичность метода анализа методом бесконтактного лигирования на цитоспиновых препаратах суспензионных клеточных культур. После освоения этой техники ее можно проводить примерно через пять часов после ночной инкубации с первичным антителом, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательном титровании антител путем иммунофлуоресцентного окрашивания интересующих вас клеток перед проведением анализа на близкое лигирование. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению переходных белковых взаимодействий, которые трудно оценить с помощью стандартных методов, таких как иммунопреципитация и визуализация на основе FRET, что часто приводит к техническим артефактам. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить анализ бесконтактного лигирования на культурах суспензионных клеток для визуализации и количественного определения взаимодействия белковых белков in situ.