Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Общая цель данного протокола заключается в изучении структур нерастворимых и некристаллических супермолекулярных белковых ансамблей с атомным разрешением с помощью спектроскопии твердотельного ЯМР с магическим углом вращения. Мы представим основные методологические шаги по исследованию атомных структур сборок биомолекулярных белков методом твердотельного ЯМР. Изучение атомных структур этих сборок чрезвычайно сложно, потому что они по своей природе нерастворимы и некристалличны.

Твердотельный ЯМР — это новый метод, способный изучать молекулярную структуру и динамику с атомным разрешением, не ограничиваясь размером собранного объекта или его растворимостью. Здесь мы проиллюстрируем ключевые этапы визуализации атомных структур сборок биомолекулярных белков с помощью ЯМР в проданном состоянии, включая подготовку изотопно меченных образцов, сбор и анализ структурных данных твердотельного ЯМР. Первым этапом в процессе твердотельной ЯМР является производство меченых субъединиц белка C13 N15 и их сборка in vitro.

Инокулируйте предварительную культуру 15 мил предварительно подогретой среды LB с одной колонией трансформированных клеток E.coli. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и встряхивая со скоростью 200 об/мин в течение ночи. Для инокуляции основной культуры необходимо пересадить всю предкультуру в один литр предварительно подогретой среды N9, содержащей необходимые изотопно меченые источники углерода и азота.

Они могут включать меченый N15 хлорид аммония, равномерно меченую C13 глюкозу, селективно меченую C13 глюкозу или селективно меченный C13 глицерин инкубировать при 37 градусах, а также измерять оптическую плотность при 600 нанометрах, как только культура становится мутной. Когда OD достигнет значения 0,8, индуцируйте экспрессию белка с помощью 0,75 минимолярного IPTG в течение четырех часов. Обратите внимание, что оптимальные условия индукции могут варьироваться от одного белка к другому.

Восстановите клетки путем центрифугирования в течение 30 минут при 6 000 G и четырех градусах. После очистки белковых субъединиц их собирают in vitro. Сконцентрируйте белок примерно до одного мини-моляра в центробежном фильтрующем блоке.

Для этого введите образец в фильтрующий блок и центрифугируйте при 4 000 G в течение 30 минут. Между этапами центрифугирования аккуратно перемешивайте раствор в фильтрующем блоке с помощью пипетки, чтобы избежать отложения белка на фильтрующей мембране. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет достигнута нужная концентрация.

Переложите образец в соколиную пробирку и инкубируйте под перемешиванием в течение одной недели при комнатной температуре. Обычно полимеризация субъединиц в филаменты сопровождается тем, что раствор мутнеет. Добавьте 0,02% веса на объем азида натрия, чтобы избежать бактериального загрязнения.

Чтобы собрать белковую сборку, центрифугируйте образец в течение одного часа при температуре 20 000 G и четырех градусах. Отбирайте большую часть надосадочной жидкости, оставляя достаточно жидкости, чтобы покрыть поверхность, чтобы избежать высыхания образца, и храните образец при четырех градусах до измерения. Мы представим основные эксперименты для структурного анализа методом твердотельного ЯМР.

Одномерная кросс-поляризация, или CP, и неумелые эксперименты, обнаруженные на ядрах C13, используются для обнаружения жестких и гибких сегментов белка в сборке соответственно. А также оценить степень структурной однородности и локального полиморфизма. Здесь мы используем стандартные экспериментальные значения.

Типовые диапазоны параметров указываются в протоколе. Вставьте вращение в магнит ЯМР и начните вращение под магическим углом, как описано в протоколе. Установите желаемую частоту вращения и обеспечьте стабилизацию с точностью до плюс-минус 10 герц.

Запишите один импульсный одномерный спектр протонов с помощью 16 сканирований. Настройте 1D протонный углеродный CP. Эксперименты по CP-симметрии показывают сигналы, возникающие из остатков в жесткой конформации. Исходные параметры эксперимента взяты из стандартной процедуры оптимизации на эталонном соединении.

Параметры калибровки импульсов и развязки могут быть оптимизированы в образце, когда чувствительность достаточно высока. Здесь мы записываем CP с 16 сканированиями. Время контакта и уровни мощности CP выбираются на основе максимальной интенсивности сигнала, как показано здесь для оптимизации времени контакта CP.

Максимальная интенсивность в этом примере достигается на отметке 800 миллисекунд. Параметры развязки также должны быть скорректированы по сравнению с теми, которые были первоначально заданы при калибровке эталонного соединения. Наконец, внимательно наблюдайте за локализацией боковых полос вращения при заданном магическом угле частоты вращения, показанной здесь на частоте 18 килогерц, чтобы избежать перекрытия с сигналом.

Запишите эталонный 1D протонный углеродный CP-спектр, который служит одномерным спектральным отпечатком. Здесь мы накапливаем 128 сканов с временем контакта CP 800 миллисекунд, силой развязки 100 килогерц, задержкой рециркуляции в три секунды и временем сбора данных в 20 миллисекунд. Пройдите эксперимент по ЦП без апатии.

Выберите и выделите пик для оценки C39 в пределах выборки, что свидетельствует о структурном порядке и однородности. Здесь ширина линии, измеренная как полная ширина на половине высоты, составляет от 60 до 70 герц, что указывает на хорошо упорядоченную структуру белка в сборке. Постановка одномерного протонного углеродного неумелого эксперимента для зондирования высокоподвижных частей белковой сборки.

Запишите эталонный неудачный эксперимент, который послужил бы отпечатком пальца для подвижных белковых сегментов. Типичные параметры составляют 128 сканирований, а время сбора данных — 25 миллисекунд. Проработайте протонный углерод неумелым экспериментом.

Количество сигналов и их положение указывают на степень подвижности остатков и аминокислотный состав соответственно. Здесь наблюдается только сигнал от скруточного буфера CH2 merit-y, так как весь белок находится в жестком режиме в структуре сборки. Конформационный анализ структуры белка основан на твердотельных ЯМР-резонансных назначениях для всех жестких остатков сборки.

Это стало возможным благодаря тому, что химические сдвиги являются высокочувствительными зондами к локальной химической среде и могут быть использованы для прогнозирования вторичной структуры белка. Полное 3D-определение структуры основано на сборе структурных данных, таких как ограничения расстояний, которые кодируют как внутримолекулярные, так и межмолекулярные расстояния близости атомов с точностью до девяти ангстрем. Здесь мы покажем, как записываются основные двухмерные эксперименты, и приведем пример последовательного задания.

Затем мы проведем короткую демонстрацию того, как собирать ограничения расстояния из экспериментов, записанных на выборочно меченых образцах C13. Настройте эксперимент с коротким временем смешивания двумерного углеродного углерода PDSD для определения углеродной корреляции внутри остатка. Скопируйте значения начального шага кроссполяризации углерода протона из одномерного эксперимента CP.

Время смешивания может быть установлено на 50 миллисекунд для образцов с равномерной меткой C13. Здесь мы выбрали время сбора данных 15 и 20 миллисекунд в косвенном и прямом измерениях соответственно. Для обработки спектра PDSD используется оконная функция QSINE со сдвигом синусоидального колокола 3,5.

Чтобы включить назначение конкретных остатков, используйте настройки PDSD с коротким временем смешивания для записи промежуточного времени смешивания PDSD со временем смешивания от 100 до 200 миллисекунд. Обратите внимание, что дополнительные спектры, в том числе эксперименты с обнаружением азота, часто требуются для полного задания резонанса и подробно описаны в протоколе. Выберите программу ЯМР-анализа, например CCPNMR Analysis.

Загрузите 2D-спектры в программное обеспечение и создайте молекулярный объект с первичной последовательностью белка. Начните с определения типов аминокислот, которые видны в спектре PDSD с коротким временем смешивания. Соединение атомов углерода в спиновых системах позволяет назначать конкретные типы остатков.

Здесь мы назначаем спиновую систему остатка тения. Переносы поляризации между ядрами С-альфа, С-бета и С-гамма приводят к физическим перекрестным пикам в спектре PDSD. Постарайтесь выявить как можно больше остатков с помощью этой процедуры.

Наложите как короткое, так и промежуточное время смешивания на спектр PDSD. Дополнительные пики, видимые в промежуточном времени смешивания PDSD, обычно возникают в результате контакта между последовательными остатками. Отметьте резонансные пики спиновой системы и найдите корреляции в промежуточном времени смешивания PDSD с резонансными частотами других спиновых систем.

Мы показали последовательное распределение тения 33 к изолутану 32 в нашей нитевидной белковой сборке. Резонансные частоты спиновой системы тения видны на углеродной частоте изолют в 32, и наоборот. Процедуры присвоения азотистых спектров и получения вторичной структуры белка из назначений описаны в протоколе.

После тщательного определения резонанса мы можем приступить к идентификации дальних ограничений. Дальнодействующие ограничения представляют собой внутримолекулярную или межмолекулярную углеродную близость между удаленными остатками, которая определяет как третичную складку мономерных субъединиц, так и расположение субъединиц внутри сборки. Здесь особое значение имеют выборочно меченые С13 образцы.

Наложите промежуточное время смешивания PDSD на длительное время смешивания углеродного углерода PDSD, записанного со временем смешивания от 400 миллисекунд до одной секунды на выборочно меченный C13 образец. По возможности оба PDSD должны были быть записаны на одном и том же выборочно меченном образце. Дополнительные пики возникают из-за корреляций между более удаленными атомами C13.

При назначении резонанса учитывайте схему выборочной маркировки. В данном случае 1-3-глицерин. Здесь мы выделили пример пика дальнего контакта с и однозначного назначения в оба измерения.

Тений 33 С-бета с белком 45 С-альфа. После завершения идентификации на большом расстоянии ограничения классифицируются как однозначные или неоднозначные, а также внутри- или межмолекулярные. Списки ограничений, которые должны быть подготовлены для структурного моделирования, перечислены в протоколе.

Учебные пособия по структурному моделированию с использованием различных программ можно найти в Интернете. Твердотельные данные ЯМР, как сами по себе, так и в сочетании с дополнительными данными, могут позволить определить структуру супермолекулярных сборок на атомном уровне. Преимущества твердотельного ЯМР заключаются, с одной стороны, в способности предоставлять как информацию о вторичной структуре, так и ограничения атомных расстояний от внутримолекулярных интерфейсов, которые могут быть интегрированы в процесс моделирования.

Но, с другой стороны, уникальная особенность твердотельной ЯМР-спектроскопии заключается в ее способности собирать ограничения атомных расстояний на межмолекулярных границах неповрежденной супермолекулярной сборки. Тем не менее, обнаружение и различение внутримолекулярных и межмолекулярных ограничений может быть утомительным процессом и, как правило, требует подготовки селективно меченных C13 образцов. Тем не менее, с новыми разработками в стратегиях селективного мечения, разработке аппаратного обеспечения спектрометра и методологиях твердотельного ЯМР, этот метод все больше реализует свой теоретический потенциал предоставления молекулярной информации на атомном уровне без ограничений размера объекта, дальнего порядка или кристалличности.

Этот метод позволяет изучать атомную структуру биомолекулярных сборок. Очень важно тщательно подготовить образец, чтобы оптимизировать состояние ЯМР, получить данные с высоким разрешением. С помощью этого протокола мы можем получить атомное разрешение, которое является информацией о сборках белка.

И этот метод может быть объединен с другими методами в структурной биологии для получения трехмерных моделей.