Определение структуры и координации комплексов пептид-металл с помощью 1D и 2D ¹Н ЯМР

Общей целью этой процедуры является определение структуры миметического пептида белка Metallo chaperone в комплексе с медью. Это достигается путем предварительной подготовки образца в бескислородной среде. Второй шаг — получение данных ядерного магнитного резонанса или ЯМР-спектроскопии, показывающих взаимодействие между атомами водорода.

Затем пространственные взаимодействия отображаются на линейном пептидном шаблоне. Последним шагом является поиск репрезентативной структуры с низким энергопотреблением, которая соответствует данным. В конечном счете, структуры, полученные из ЯМР, используются для определения режима связывания и выполнения структурного анализа связанного комплекса меди.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как рентгеновская кристаллография, заключается в том, что вы можете использовать его для изучения еженедельных связывающих комплексов, а также молекул и комплексов, которые не кристаллизуются. Тем не менее, этот метод может дать представление о белках, связывающих медь. Он также может быть применен к другим системам, таким как другие металлические компоненты, для изучения того, как белки обеспечивают безопасную доставку важных, но потенциально токсичных ионов металлов в среду клеточной линии.

Для начала подготовки образцов в бескислородной среде, чтобы предотвратить окисление меди, для приготовления образца APO растворить примерно от одного до двух миллиграммов пептида в 450-500 микролитрах растворителя марки дейтерированного ЯМР для прореагировавшего образца меди растворить то же количество, что и пептид APO, с молярным количеством соли металла EQU в 450-500. Микролитры растворителя ЯМР отфильтруйте каждый раствор с помощью центрального стекла, фильтрующей бумаги или любой другой техники, которая подходит исследуемым соединениям и не впитывает их. Это необходимо для удаления любых металлических частиц, которые могут повлиять на однородность.

Переложите растворы в ЯМР-пробирки и закройте образцы в пробирках. Прежде чем покинуть бардачок, достаньте образцы из бардачка и запечатайте их. Запишите одномерные протонные спектры образцов APO и меди, прореагировавших в ЯМР-аппарате, и сравните.

Пептид APO является гибким и показывает среднее количество подтверждений, но при реакции с медью связанные пептидные амиды имеют более жесткую структуру. Таким образом, спектр медьсодержащих пептидов должен демонстрировать значительное изменение химического сдвига в амидной области, и пики могут исчезнуть. Организуйте оптимизированные, уютные эксперименты с токсингом, любопытством или розовым ЯМР в условиях, идентичных описанным в текстовом протоколе, и выполняйте их последовательно.

Проводите одномерные эксперименты между каждым экспериментом, чтобы убедиться, что состав образца остается неизменным на протяжении всего сбора данных. После обработки данных в соответствии с текстовым протоколом, подготовьте набор уютных и чтобы спектры накладывались на ноэа и розовый спектр. Для назначения всех пиков NOE в спектре.

Начните с назначения пиков, которые перекрывают сигналы токсиса в области отпечатка пальца. Поскольку это облегчит последующий ввод данных о присвоении пиков с помощью записи программы Sparky, назначенные пики переводят значения связи H альфа в амидный белок в дедальные углы. Кроме того, преобразуйте пики в ограничения по расстоянию, интегрируя пики из программы и транслируя их с помощью взаимодействия известного расстояния.

Если пики перекрываются или не могут быть использованы методы автоматического интегрирования, пики могут быть помечены как сильные, средние, слабые или очень слабые с помощью визуальной оценки, и эти обозначения могут быть переведены в расстояния до 2,5, 3,5, 4,5 и 5,5 ангстрем соответственно. В импорте ограничения расстояния и углы удаления с правильным форматом для исследования. Explore будет искать подтверждающее пространство, чтобы найти структуры, которые придерживаются канонической химической геометрии.

В дополнение к экспериментально найденным ограничениям расстояний можно сгенерировать ансамбль, в котором ни один из этих параметров не нарушается. Это и составит стартовый ансамбль. Выполните первый прогон определения структуры без использования каких-либо ограничений для металла, чтобы определить, какие остатки участвуют в связывании металла без каких-либо смещений.

Вводите ограничения постепенно, чтобы облегчить выявление ошибок в назначении, а также энергии NOE и смоделированных параметров коленопреклонения, как описано в текстовом протоколе, прежде чем минимизировать структуры с использованием минимизации энергии сопряженного градиента в течение 4000 итераций, создайте окончательный ансамбль обычно из 50 членов, выполняя введение ограничений итеративным образом для всего ансамбля, сообщите о количестве найденных взаимодействий каждого типа NOE. Наконец, создайте ансамбль структур, которые соответствуют канонической химической геометрии и эмпирическим ограничениям, полученным с помощью ЯМР. Общее количество подтверждений, количество из которых имеют нарушения ограничений NM Rived и RMSD всего ансамбля, включая как основную цепь, так и все значения RMSD тяжелых атомов.

Проанализируйте ансамбль с низким энергопотреблением и определите, какие боковые цепи остатков находятся в правильной близости друг к другу, чтобы иметь возможность связывать ион металла. После их определения повторите анализ, включая данные о связывании меди. В дополнение к ограничениям расстояния, полученным на основе ЯМР, теперь добавьте ограничения связывания металлов к определенным остаткам.

Добавьте соответствующие параметры для описания иона металла и его топологии. Введите соответствующую физическую информацию, такую как длина связи массы с другими атомами, углы и параметры отталкивания без связи, в файл параметров. Добавьте информацию о привязке в файл топологии.

Эта информация включает в себя информацию о том, какие облигации образуются и разрываются, а также какие формальные платежи изменяются в результате связывания. Наконец, приобретите ансамбль структур, поскольку ранее решенный ансамбль представлял собой подтверждающее пространство, принятое пептидом. Во время измерения ЯМР импортируйте все подтверждения структуры в программу Mal Mall для создания начального ансамбля.

Исследуйте ансамбль, чтобы определить локальную стабильность молекулы. Определите значения RMSD основной и боковой цепи путем выбора последовательных четырех областей остатка вдоль последовательности и попросите программу рассчитать RMSD с точностью до самой низкой энергетической структуры или среднего значения, определите, какие области молекулы демонстрируют локальную стабильность, построив график локального RMSD как функции последовательности, наложите ансамбль вдоль этой области молекулы и используйте этот ансамбль для дальнейшего анализа. Выбирайте подтверждения с низким энергопотреблением, которые соответствуют ограничениям, полученным от ЯМР.

Они будут формировать запись ансамбля с низким энергопотреблением и сообщать о количестве подтверждений в ансамбле, критериях их выбора и значениях RMSD. Если режим связывания металла еще не определен, проанализируйте ансамбль с низкой энергией и определите, какие боковые цепи остатков неверны. Близость друг к другу для возможности связывания ионов металла.

Используйте KYMERA для определения внутримолекулярных расстояний между атомами, предположительно связывающими металлы. Рассчитайте средние расстояния в ансамбле после того, как они будут определены. Повторите анализ, включая данные о связывании меди.

Исследуйте ансамбль и определите локальную вторичную структуру внутри молекулы, используя стандартные параметры поиска программы MAL mall. Далее импортируйте ансамбль в kymera. Вторичные структуры удерживаются водородными связями и указывают на стабильные участки молекулы.

Определите связывание водорода с помощью инструмента kymera. Продолжайте структурный анализ, как описано в текстовом протоколе. Затем суммируйте все структурные находки, чтобы выявить, как они усиливают друг друга Для изучения моделей медь-связывающих белков структура консервативной связывающей последовательности белка в производном линейном пептиде была определена по состоянию раствора ЯМР, амидной области пептида от 6,7 до 8,5.

PP M показал расширение при реакции с медью до 6,6-9,0 PP. Уширение Mline из-за незначительного окисления меди очевидно на исходном уровне. Здесь показано наложение областей отпечатков пальцев Roy Toxi и уютные спектры связанного с медью пептида. Образец был стабилен с течением времени, а спектры были хорошо разрешены и дали 81 взаимодействие NOE, которые были получены в розовом эксперименте.

Поскольку молекула дала почти нулевое взаимодействие NOE в эксперименте с NO C, ансамбль пептида, полученный для прореагировавшего образца, но без ограничений для металла, дал 47 из 50 неструктур со значением RMSD 1,44 и 2,07 ангстрема на основном и тяжелом атомах соответственно. Из них для дальнейшего анализа были выбраны 13 низкоэнергетических конформеров со значениями RMSD 0,25 и 0,61 ангстрем на основном и тяжелом атомах соответственно. Локальный график RMSD показал область стабильности между остатками 3 и 7 В дополнение к жесткой концевой области C, включающей проленовый остаток, эта область обнаружена в подтверждении изгиба между остатками 4 и 7 во всех подтверждениях.

Подтверждение изгиба стабилизируется за счет водородной связи между донорами и акцепторами 5 и 3 глицина и 2, а также цистеина 6 и 3 цистеина. Этот изгиб также проявляется в цистине 3 и синусе 7 по уменьшенным значениям связи в этой области. Подтверждения накладывали на эту область и анализировали на предмет возможных остатков связывания при рассмотрении цистина-3, цистина-6 и метионина-1 в качестве потенциальных остатков связывания.

Самое короткое расстояние между фолатными группами цистеина три и цистеином 6 было между фолатными группами цистеина три и цистеина 6, вводили связывание меди и повторяли расчет для получения ансамбля, используемого для анализа. Низкоэнергетический ансамбль связанного с медью пептида показывает, что конечный амин находится близко к связанной меди. Здесь показана изоповерхность распределения электростатического потенциала с положительным потенциалом, показанным синим цветом, и отрицательным потенциалом, показанным красным.

Остаток аргинина выходит из основного ядра пептида, образуя положительную долю электростатического потенциала, в то время как выход углерода в основной основе расположен в линию, образующую менее заметный отрицательный электростатический потенциал. Следуя этой процедуре, можно проанализировать другие пептидные мутаны и различные условия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся условий, необходимых для различных степеней связывания и высвобождения иона меди.