Протокол для HER2 рыбы с использованием не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань фиксатором объединить преимущества крио сохранение и формалином фиксации

Персонализированная медицина требует различных типов анализов от классической гистологии до молекулярного анализа, а также различных методов in-situ на опухоли для выбора наилучшей терапии. Методы исследования позволяют использовать различные аналитические технологии на основе одного образца. Здесь мы демонстрируем, используя несшивающий фиксатор на этапе простой фиксации формалина, что вы можете использовать протоколы, первоначально разработанные и валидированные для формального и фиксированного материала, залитого парафином, которые могут быть использованы из образца клетки, что дает хорошую морфологию, хорошее качество РНК и хорошие результаты для более полной гибридизации in-situ.

Типичные условия гибридизации не подходят для несъемных тканей, не содержащих формалин, для получения результатов FISH. Мы выяснили, что не проникновение, а время химической коррекции имеет решающее значение для достижения сопоставимых результатов FISH из ткани, фиксируемой пектином. Только раздел, используемый для FISH, является формальным и фиксированным.

Оставшаяся неподвижная ткань, не содержащая формалина, обеспечивает превосходный молекулярный анализ по сравнению с тканью FFP, как продемонстрировал RTPCR. Процедуру, которую мы продемонстрировали с помощью Даниэлы Пабст, лаборанта из моей лаборатории. Для начала разрежьте образцы тканей рака молочной железы стерильным скальпелем на две половины, каждая толщиной четыре миллиметра, чтобы обеспечить достаточное количество ткани.

Используйте ограничители максимального размера 4x15x15 миллимитеров для фиксации с помощью стандартного буферного раствора формалина или с помощью альтернативной фиксации тканей без поперечной сшивки и без формалина. Поместите одну половину образца опухоли в стандартную тканевую кассету и погрузите ее в SBFS. Поместите другую половину образца опухоли в альтернативный раствор для фиксации на 24 часа с соотношением объема четыре части фиксирующего и одна часть ткани.

Затем перенесите альтернативно зафиксированные образцы в раствор стабилизатора на срок от двух до 72 часов, открыв контейнер, повернув тканевую кассету на 180 градусов и погрузив ее в воду. Затем поместите тканевые кассеты с образцами, зафиксированными SBFS, в контейнер, наполненный 70% этанолом, на 30 минут при комнатной температуре, чтобы удалить остатки SBFS. После обработки ткани и встраивания, как описано в текстовом протоколе, с помощью микротома вырежьте три микронных среза блоков FFPE и NCFPE.

Поместите несколько секций каждого типа в ванну с холодной водой. Возьмите плавающий срез тонкой кистью на предметном стекле микроскопа и перенесите его на теплую водяную баню. Снова возьмите растянутые срезы кистью на предметное стекло микроскопа без складок.

Также подготовьтесь к выделению РНК для проведения ПЦР с обратной транскрипцией на том же образце, поместив некоторые из каждого типа срезов в реакционный флакон. Для депарафинизации срезов тканей мы поэтапно увлажняем срезы при комнатной температуре в банках для окрашивания 250 миллилитрами различных реагентов. Сначала поместите срезы в 100% ксилол два раза на 15 минут, затем дважды переведите срезы на 96% этанол в течение 15 минут.

Затем проведите срезы через постепенно снижающееся процентное содержание этанола, инкубируя каждый раствор в течение двух минут. Наконец, переложите срезы в дистилляцию два раза на 10 минут. Выполните постфиксацию стекол NCFPE, поместив их в новую банку для окрашивания, наполненную SBFS, на 24 часа при комнатной температуре.

Оставьте банку в вытяжном шкафу в течение 24 часов после фиксации. Удивительно, но все периоды постфиксации продолжительностью более 18 часов дали результаты, аналогичные тем, которые были получены с формальным и фиксированным парафиновым материалом. Удалите излишки SPFS со стекол, промыв их в фосфатно-солевом буфере в течение 10 минут три раза.

Затем следует вторая промывка в дистиллированной воде в течение 10 минут два раза. Далее поместите банку для окрашивания, содержащую 250 миллилитров раствора для термической предварительной обработки лимона, на водяную баню с температурой 98 градусов Цельсия. Поместите гидратированный FFPE в предварительно зафиксированные предметные стекла NCFPE в банку и инкубируйте в течение 15 минут.

Затем промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение трех минут при комнатной температуре в новой банке для окрашивания. Для протеолиза поместите предметные стекла в гибридизацию с регулируемой температурой при 37 градусах Цельсия. Немедленно нанесите готовый к применению раствор пепсина по каплям на участки ткани до полного их покрытия.

Затем инкубируйте в течение девяти минут при температуре 37 градусов Цельсия в системе гибридизации. Затем поместите предметные стекла в банку, содержащую буфер для промывки SSC, и инкубируйте в течение пяти минут. Поместите предметные стекла в дистиллированную воду на одну минуту при комнатной температуре.

Выполните обезвоживание срезов в серии отсортированных спиртов, каждая в течение одной минуты. После серии обезвоживания просушите секции на воздухе. Для гибридизации пипеткой 10 мкл комбинированного зонда HER2 и sun 17 нанесите на высушенные участки ткани, накройте каждый образец покровным стеклом и запечатайте резиновым цементом.

Код денатурирует зонд и образец ДНК в системе гибридизации при температуре 75 градусов Цельсия в течение 10 минут. Система гибридизации автоматически снижается до 37 градусов по Цельсию, и гибридизация продолжается в течение ночи. На следующий день осторожно удалите резиновый цемент и чехол с помощью щипцов для постгибридизации и защиты.

Инкубируйте размеры в банке для окрашивания, содержащей 37 градусов Цельсия, предварительно нагретом 1X буфером А в течение пяти минут. Затем промойте слайды с помощью предварительно нагретого буфера для стирки 1X дважды в течение пяти минут при температуре 27 градусов Цельсия. Затем обезвоживайте предметные стекла в 70% 90% и 100% этаноле в одну минуту для каждой концентрации.

Высушите образцы на воздухе и защитите их от света. Для окрашивания нанесите на гибридизованный участок 30 микролитров DAPI-раствора, не допуская образования пузырей. Перед инкубацией секции накройте защитным чехлом в защищенном от света месте на 15 минут.

Осторожно удалите излишки DAPI-раствора, аккуратно надавливая на предметное стекло между фильтровальными бумагами. Храните предметные стекла при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в темноте до двух недель до оценки с помощью конфокальной микроскопии. Получайте изображения с помощью фильтров для зеленого и оранжевого каналов.

Перейдите к интерпретации данных и оценке качества РНК в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показано прямое сравнение результата, полученного из формальной и фиксированной выборки, и несвязанной фиксированной выборки, которая была зафиксирована. Сигналы имеют схожую интенсивность, и фон также похож.

В нормальных интерфазных клетках имеется равное количество красных и зеленых сигналов, соответствующих локусу HER2 и референсному локусу sen 17, что свидетельствует об отсутствии амплификации в гене HER2. Здесь показан результат другого случая, когда ген HER2 амплифицируется, и для локуса HER2 сигнал гораздо сильнее и шире, чем для референсного гена. Это явление проявляется как в формальной, так и в несшиваемой неподвижной ткани.

На этом графике показана эффективность амплификации для различных длин ампликонов мРНК GAPDH. Для формалина необходимо около 23 циклов, а для несшивающегося неподвижного материала этот показатель сокращается до 20 циклов. Разница становится более очевидной при использовании более длинных ампликонов, что указывает на то, что как фрагментация, так и химическая модификация заметно снижаются за счет использования фиксаторов без поперечной сшивки.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как можно использовать одобренный FDA ключ для материала FFPN на несшивающемся фиксированном материале, добавив простой этап постфиксации в предварительную аналитическую процедуру. Основное преимущество этого метода заключается в том, что только секция, используемая для полносмысловой гибридизации in-situ, является постфиксированной формалином, в то время как оставшийся блок фиксируется в несшитом фиксаторе и, следовательно, может быть использован для широкого спектра молекулярного анализа. Этот протокол особенно полезен в контексте современной персонализированной медицины, когда необходимо проводить множественные анализы относительно небольших опухолей, а обработка образцов тканей по различным протоколам невозможна.

Кроме того, использование несшивающего фиксатора имеет преимущество, заключающееся в том, что он сохраняет свойства ткани, такие как криоконсервация. Это позволяет избежать необходимости замораживать жидкий азот и поддерживать цепь охлаждения в химическом контексте. Эти различия в качестве РНК не очевидны, поэтому при использовании классических анализов контроля качества РНК, таких как показатели целостности РНК, поскольку эти анализы не являются полностью формирующими по качеству РНК, выделенных из фиксированного и залитого парафином материала.